Contrôle de l'homéostasie de la barrière épithéliale intestinale par la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK)

par Severine Olivier

Thèse de doctorat en Physiopathologie

Sous la direction de Benoît Viollet.

Thèses en préparation à l'Université de Paris (2019-....) , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité .


  • Résumé

    La barrière épithéliale intestinale présente une double fonction au sein de l'organisme, elle permet l'absorption des nutriments mais assure également une protection contre les pathogènes et les toxines. La monocouche de cellules épithéliales tapissant l'intestin constitue une véritable barrière physique grâce au réseau des protéines de jonction reliant ces cellules entre-elles. Parmi ces protéines, ce sont notamment celles impliquées dans la formation des jonctions serrées qui régulent la perméabilité paracellulaire. Des dysfonctions de la barrière intestinale sont observées dans certaines pathologies comme les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ou l'obésité. La protéine kinase activée par l'AMP (AMPK) est principalement connue pour sa fonction de senseur de l'état énergétique cellulaire, cependant cette kinase contrôlerait également l'assemblage des jonctions serrées, comme démontré pour les cellules épithéliales rénales. Les fonctions de l'AMPK dans l'intestin ont été peu étudiées, et dans ce cadre nous nous sommes intéressés à son rôle dans l'homéostasie de la barrière intestinale. Pour répondre à notre problématique, nous avons travaillé sur des modèles in vivo et in vitro présentant des altérations de la barrière épithéliale intestinale. Deux modèles pathologiques ont été utilisés in vivo: l'un étant un modèle d'obésité induit par un régime hyperlipidique, l'autre un modèle de colite mimant les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin par un traitement au DSS (Dextran Sulfate Sodium). Sur ces modèles, nous avons notamment étudié : 1) les conséquences de l'absence de l'AMPK en utilisant un modèle de souris présentant une délétion de l'AMPK spécifiquement au niveau de l'épithélium intestinal (Vil-AMPK KO), et 2) l'impact d'une activation pharmacologique de l'AMPK sur la perméabilité intestinale au cours de l'induction de la colite. Enfin, nous avons généré des cellules intestinales Caco-2 invalidées pour l'AMPK (KO) par la technologie CRISPR/Cas9 afin de mieux caractériser in vitro le rôle de l'AMPK dans le processus de réassemblage des jonctions serrées en réponse à un challenge en calcium (calcium switch). Dans notre modèle animal, nous avons tout d'abord montré que les souris Vil-AMPK KO présentaient une augmentation de la perméabilité intestinale au niveau du côlon distal par rapport aux souris contrôles, suggérant un rôle de l'AMPK dans le maintien de la barrière. Dans un modèle d'obésité, cette perméabilité est exacerbée chez les souris Vil-AMPK KO, mais cette altération n'est pas suffisante pour entraîner des défauts métaboliques majeurs. En revanche, suite à un traitement au DSS, l'absence de l'AMPK entraîne une ré-épithélisation de la barrière intestinale plus lente par rapport à des souris contrôles. En condition basale, un traitement à la metformine diminue la perméabilité intestinale par un mécanisme AMPK-dépendant. De manière similaire, dans notre modèle de colite, la metformine améliore la perméabilité et atténue également l'inflammation. Au cours d'expériences de calcium switch menées sur les cellules Caco-2, nous avons démontré que l'activation pharmacologique de l'AMPK par l'activateur 991 stimulait le réassemblage des jonctions serrées ainsi que leur relocalisation à la membrane plasmique. L'utilisation des cellules KO a notamment permis de définir qu'il s'agissait d'un processus AMPK-dépendant. Nos résultats montrent que l'AMPK joue un rôle important dans la régulation de la barrière intestinale, notamment au niveau du côlon. L'activation pharmacologique de l'AMPK assure une meilleure ré-épithélisation de la barrière intestinale dans un modèle de colite et un réassemblage plus rapide des jonctions serrées dans les cellules Caco-2. Toutefois, d'autres études sont nécessaires pour définir les cibles directes de l'AMPK dans ce contexte. Ainsi, ces résultats mettent en évidence le potentiel thérapeutique de l'AMPK pour limiter les défauts de la barrière intestinale.

  • Titre traduit

    Control of intestinal epithelial barrier homeostasis by AMP-activated protein kinase (AMPK)


  • Résumé

    The intestinal epithelial barrier plays a double role within the organism, it enables nutrient absorption but also ensures a protection against pathogens and toxins. The monolayer of epithelial cells lining the intestine forms a real physic barrier thanks to a network of junction proteins linking the cells together. Among these proteins, those involved in tight junctions formation notably regulate the paracellular permeability. Dysfunctions of the intestinal barrier are observed in some diseases like inflammatory bowel diseases or obesity. The AMP-activated protein kinase (AMPK) is mainly known to be a sensor of the cellular energy status; however, this kinase could also regulate the assembly of tight junctions, as shown in renal epithelial cells. The functions of AMPK in the intestine have been poorly investigated, and in this context we were interested in its role in the intestinal barrier homeostasis. In order to meet our objective, we worked on in vivo and in vitro models displaying alterations of the intestinal barrier. Two pathological models were investigated in vivo: one was a model of obesity induced by a high-fat diet, the other one was a colitis model mimicking inflammatory bowel diseases by a treatment with DSS (Dextran Sulfate Sodium). In these models, we notably studied: 1) the consequences of the absence of AMPK by using a mouse model invalidated for AMPK specifically in the intestinal epithelium (Vil-AMPK KO), and 2) the impact of a pharmacological activation of AMPK on the intestinal permeability during colitis. Finally, we generated intestinal Caco-2 cells invalidated for AMPK (KO) by CRISPR/Cas9 technology to better understand in vitro the role played by AMPK in the process of tight junctions reassembly during a calcium switch assay. In our animal model, we first showed that Vil-AMPK KO mice displayed an increased intestinal permeability in the distal colon compared to control mice, suggesting a role of the AMPK in barrier maintenance. In our model of obesity, this permeability is exacerbated in Vil- AMPK KO mice, but this alteration is not sufficient to induce major metabolic disorders. Nevertheless, following a DSS treatment, the absence of AMPK induces a slower re-epithelization of the intestinal barrier compared to control mice. In basal condition, a treatment with metfomin decreases the intestinal permeability via an AMPK-dependent mechanism. Similarly, in our colitis model, metformin improves the permeability and also attenuates inflammatory signals. In calcium switch assays performed in Caco-2 cells, we demonstrated that the pharmacological activation of AMPK by compound 991 enhanced the reassembly of tight junctions and their relocalization at the plasma membrane. The use of KO cells notably enabled us to conclude that this was occuring through an AMPK-dependent process. Our data show that AMPK plays a major role in the regulation of the intestinal barrier, particularly in the colon. Pharmacological activation of AMPK ensures a better re-epithelization of the intestinal barrier in a colitis model and a faster reassembly of tight junctions in Caco-2 cells. However, further studies are needed to define the direct phopshorylation targets of AMPK in this context. Thus, altogether these results highlight the therapeutic potential of AMPK to limit intestinal barrier disorders.