Système pour la génération contrôlée de trajectoires de maturation d'affinité de fragment d'anticorps.

par Guillaume Villain

Thèse de doctorat en Biologie evolutive

Sous la direction de Clement Nizak et de Olivier Rivoire.

Thèses en préparation à l'Université de Paris (2019-....) , dans le cadre de École doctorale Interdisciplinaire Européenne Frontières du Vivant .


  • Résumé

    La maturation d'affinité est un processus évolutif rapide qui augmente l'affinité de liaison de l'anticorps avec son antigène pendant la réponse immunitaire. Pour le décrire quantitativement et comprendre comment les autres propriétés des anticorps, telles que la spécificité de liaison ou la stabilité thermique, changent au cours de ce processus, nous devons analyser de nombreuses trajectoires évolutives se produisant sous une pression de sélection connue. À ce jour, un tel jeu de données n'existe pas. En effet, les techniques actuelles utilisées pour réaliser la maturation d'affinité in vivo ou in vitro ne contrôlent respectivement pas la pression de sélection sur la liaison ou ont un faible débit. La mutagenèse in vitro couplée à la présentation sur phages prend une semaine pour réaliser un cycle de mutations et de sélection. Afin de pallier ce manque de données, l'objectif principal de ma thèse est de proposer une nouvelle technique permettant de générer des trajectoires de maturation d'affinité des anticorps efficacement et dans des conditions in vitro contrôlées. Nous avons combiné la sélection in vitro, la mutagenèse in vivo et le séquençage haut débit pour atteindre cet objectif. Notre système présente une pression de sélection contrôlée via la méthode établie de « biopanning » du « phage display ». Nous montrons que nous pouvons simplifier et accélérer la production de phages en utilisant des plasmides auxiliaires. De plus, nous réduisons considérablement le temps nécessaire à la génération de banques de mutants et limitons le temps de manipulation en utilisant le plasmide mutagène et inductible développé pour la technique d'évolution dirigée assistée par phages pour introduire des mutations aléatoires in vivo. Nous avons effectué une expérience de maturation par affinité sur plusieurs formats d'anticorps et effectué un cycle de mutation et de sélection par jour. Actuellement, le taux de mutation atteint est la principale limitation de notre technique, mais il peut être surmonté grâce à plusieurs cycles consécutif de mutagenèse. Notre technique est facilement automatisable et permet la génération de trajectoires contrôlée de maturation d'affinité d'anticorps.

  • Titre traduit

    System for the generation of controlled affinity maturation trajectories of antibody fragments


  • Résumé

    Affinity maturation is a fast-evolutionary process that increases binding affinity of antibody for its antigen during the immune response. To describe it quantitatively and to understand how other antibody properties such as binding specificity or thermal stability change during this process, we need to analyse many trajectories occurring under known selection pressure. To this date, no such dataset exists. Indeed, current techniques employed to perform affinity maturation in vivo or in vitro respectively do not control binding selection pressure or have a low throughput. Using in vitro mutagenesis coupled with phage display take a week to proceeded to one cycle of mutations and selection. To palliate the lack of such data, the main objective of my PhD thesis is to propose a new technique to generate trajectories of affinity maturation of antibodies efficiently, and in controlled in vitro conditions. We combined in vitro selection, in vivo mutagenesis and NGS sequencing to achieve that goal. Our system presents controlled selection pressure via the established method of biopanning from phage display. We show that we can simplify and accelerate phage production through the use of helper plasmids. Additionally, we drastically reduce the time for the generation of mutant libraries and limit the hands-on time, by using the inducible mutagenic plasmid developed for Phage Assisted Directed Evolution to introduce random mutations in vivo. We performed affinity maturation experiment on several antibody formats and performed one round of mutation and selection per day. Currently the achieved mutation rate is the main limitation of our technique but can be overcome through multiple cycles of mutagenesis. Our technique is easily scalable and with some automations day and allows the generation of trajectories of affinity maturation of antibodies.