Etude des cellules souches germinales : Caractérisation des cellules souches germinales humaines et effets de l'hypoxie

par Maelle Givelet

Thèse de doctorat en Reproduction - developpement

Sous la direction de Jean philippe Wolf et de Pierre Fouchet.

Thèses en préparation à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité .


  • Résumé

    Tout au long de la vie, les spermatozoïdes sont produits dans le testicule à partir des cellules souches germinales (CSGs), au cours du processus de spermatogenèse. Les CSGs ont la capacité de s'auto-renouveler pour maintenir le stock de cellules souches et d'entrer en différenciation. L'infertilité masculine est responsable dans un cas sur deux des difficultés à enfanter au sein du couple. Chez les patients traités par radiothérapie et/ou chimiothérapie (plus particulièrement chez les enfants atteints de cancer), un des effets secondaires majeurs qui altèrent la qualité de vie après guérison est l'atteinte du stock de CSGs et les problèmes d'infertilité qui en découlent. Des solutions thérapeutiques telles que la transplantation de CSGs provenant de biopsies testiculaires réalisées avant les traitements anticancéreux sont actuellement étudiées. Des travaux récents de transplantation testiculaire de CSGs chez le primate non humain ont permis de restaurer, chez l'animal stérilisé, une spermatogénèse permettant la fécondation in vitro d'ovocytes à partir de spermatozoïdes issus des CSGs transplantées. Ces résultats très encourageants font entrer pour la première fois la transplantation des CSGs dans le champ de l'application préclinique. Cependant, l'identité du pool de CSGs humaines et les mécanismes moléculaires gouvernant leur auto-renouvellement restent peu connus. Mon travail de thèse a porté sur la caractérisation des CSGs chez l'Homme. Au cours de ce projet j'ai également utilisé le modèle murin afin de mieux appréhender certains mécanismes de régulation physiologique des CSGs. Dans un premier temps, ce travail de thèse a contribué à définir, à l'aide d'une combinaison de marqueurs cellulaires et d'un test fonctionnel, la transplantation testiculaire, une population de spermatogonies immatures enrichie en CSGs. Le profil d'expression de cette population a été réalisé par une analyse transcriptomique, et nous a permis de définir un réseau de régulateurs de la transcription préférentiellement exprimé dans cette population. Parmi ces régulateurs, nous nous sommes focalisés sur l'étude du répresseur de transcription bHLH Hes1 dans le modèle murin. Dans des conditions de culture de privation de sérum et de facteurs de croissance, induisant un arrêt prolifératif et la quiescence, notre étude tend à montrer un rôle protecteur de Hes1 contre la mort cellulaire. Nous avons également observé une diminution du nombre de cellules ayant le potentiel à régénérer une spermatogenèse dans les cultures de CSGs lorsque l'expression de Hes1 est diminuée à l'aide de siRNA. Dans un second temps, nous avons étudié l'effet de l'hypoxie sur l'auto-renouvellement et la différenciation des CSGs murines en culture. En effet, l'hypoxie est une composante importante de la niche des cellules souches qui régule leur destin cellulaire. Nous avons observé qu'une forte hypoxie (1% et 0,1% d'oxygène) a un effet délétère sur la capacité des CSGs murines à former des colonies, et qu'elle induit modérément la quiescence et un début de différenciation. Un effet positif sur la fonctionnalité des CSGs adultes murines a été observé à 3,5% d'oxygène, mais ces conditions n'ont pas d'effets bénéfiques sur la prolifération et le maintien des CSGs humaines à long terme. Enfin, mon travail de thèse a contribué à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la reprogrammation spontanée vers la pluripotence des CSGs in vitro. Si les facteurs de Yamanaka sont efficaces pour la reprogrammation des cellules somatiques testiculaires, ils ne permettent pas celle des CSGs adultes. Ces résultats suggèrent donc l'existence d'un mécanisme spécifique empêchant la reprogrammation par les facteurs de Yamanaka des cellules germinales adultes en un état pluripotent.

  • Titre traduit

    Study of germinal stem cells : characterization of human germinal stem cells and effects of hypoxia


  • Résumé

    Throughout life, sperm cells are produced from germinal stem cells (GSCs) during the process of spermatogenesis in the testis. GSCs have the ability to self-renew to maintain stem cell stock and to differentiate. Male infertility is responsible in one out of two cases of issues of procreation. In patients treated with radiotherapy and/or chemotherapy (particularly in children with cancer), one of the major side effects that affects the quality of life after healing is the attrition of the GSCs stock and the subsequent problems of infertility. The most severe infertility issue, the Sertoli-Cell-Only syndrome with a complete germ cell aplasia, results from the exhaustion of the GSCs population. Therapeutic solutions such as transplantation of GSCs obtained from testicular biopsies harvested prior to cancer treatments are being studied. Recent studies on testicular transplantation of GSCs in non-human primates have shown the restoration, in the sterilized animal, of spermatogenesis allowing in vitro fertilization of oocytes by intracytoplasmic microinjection of spermatozoa derived from transplanted GSCs. These very encouraging results bring for the first time the transplantation of GSCs into the field of preclinical application. However, the identity of the pool of human GSCs and the molecular mechanisms governing their self-renewal remain poorly known. My thesis work focused on the characterization of GSCs in humans. During this project I also used the mouse model of GSCs to better understand some mechanisms of the physiological regulation of GSCs. As a first step, this thesis work has contributed to define, using a combination of cell markers and the testicular transplantation, as functional test, a population of immature spermatogonia enriched in GSCs. The specific expression profile of this population was performed by transcriptomic analysis, and allowed us to define a transcription regulator network preferentially expressed in this population. Among the enriched transcriptional regulators in the human immature spermatogonia population, we focused on the study of the bHLH transcriptional repressor Hes1 in the murine model. Under serum and growth factors-deprived conditions of culture inducing proliferative arrest and quiescence, our study tends to show a protective role of HES1 against cell death. In addition, we also observed a decrease in the number of cells with the potential to regenerate spermatogenesis in GSCs cultures when Hes1 expression is decreased. Secondly, we studied the effect of hypoxia on the self-renewal and differentiation of murine GSCs in culture. Indeed, hypoxia is an important component of the stem cell niche that regulates their cell fate. We observed that high hypoxia (1% and 0.1% oxygen) has a deleterious effect on the ability of murine GSCs to form colonies, and moderately induce quiescence and the onset of differentiation of GSCs. A positive effect on the functionality of murine adult GSCs has been observed at 3.5% oxygen, but these conditions do not support the proliferation and maintenance at long-term of human GSCs. Finally, this work has contributed to a better understanding of the mechanisms responsible for the spontaneous reprogramming to pluripotency of GSCs in vitro. While Yamanaka factors are effective for reprogramming testicular somatic cells, they do not allow reprogrammation of adult GSCs and spermatogonial progenitors. These results suggest the existence of a specific mechanism preventing reprogramming by Yamanaka factors of adult germ cells into a pluripotent state.