Caractérisation quantitative et génétique de la dynamique sanguine et tissulaire du Virus de l'Immunodéficience Simienne chez le macaque cynomolgus en histoire naturelle

par Antoine Millet

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Veronique Avettand-fenoel.

Thèses en préparation à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité .


  • Résumé

    L'infection par le Virus de l'Immunodéficience Simienne (SIV) persiste dans l'organisme en raison des cellules infectées contenant le génome viral intégré. Ces cellules dites «Réservoirs» constituent l'obstacle majeur à l'éradication virale et sont au coeur de nouveaux challenges thérapeutiques. Le modèle simien permet d'explorer les tissus réservoirs et l'évolution virale dans l'organisme. Dans une première partie, l'objectif de notre travail a été de caractériser la dynamique du SIV dans le sang et les tissus, en l'absence de traitement. Dans le cadre du programme P-Visconti, 6 macaques ont été infectés par du SIVmac et ont été suivis pendant 6 mois. Nous avons mis au point des techniques ultrasensibles de quantification d'ADN SIV (niveau d'infection) et d'ARN SIV associés aux cellules (caARN SIV) exprimant la capacité transcriptionnelle des cellules infectées. Nous avons développé une méthode de séquençage à haut débit et des outils de bio-informatique pour une analyse en profondeur de plus de 60 millions de séquences, permettant de décrire l'évolution et le nombre de variants viraux dans le sang et les tissus. Nous montrons que les cinétiques du nombre de cellules sanguines infectées et leur niveau transcriptionnel reflétaient la cinétique de virémie plasmatique. De plus, l'évolution de la diversité génétique (nombre de variants et distance génétique) mimait l'évolution des 2 marqueurs. Les variants présents dans l'inoculum tendaient à disparaître dès J28 dans le plasma mais persistaient dans les cellules sanguines. La proportion des variants majoritaires évoluait au cours du temps et, malgré un inoculum identique, une grande hétérogénéité de niveaux d'infection et de diversité génétique a pu être observée entre les singes. A 6 mois d'infection, de nombreux tissus ont été collectés à l'euthanasie. Nous montrons une infection disséminée et réplicative dans 26 sites anatomiques, y compris dans la peau et le tissu adipeux. Les tissus lymphoïdes secondaires présentaient les niveaux d'infection et d'activité transcriptionnelle les plus élevés, lesquels étaient associés à des profils de quasi-espèces virales les plus éloignées de l'inoculum, soulignant le rôle majeur de l'activité ganglionnaire à l'origine de l'évolution virale. Le niveau d'infection de nombreux tissus était corrélé à celui du sang périphérique au moment du pic de réplication. Les différents tissus lymphoïdes et plusieurs tissus non lymphoïdes présentaient des variants majoritaires communs, témoignant d'une très importante circulation de virions et/ou de cellules infectées entre les tissus (Manuscrit 1). Dans une deuxième partie, nous avons étudié un modèle de singes infectés par du SIV, et 12 animaux sur 16 ont montré un contrôle viral spontané (Singes «contrôleurs», SIC). Aucune différence n'a été observée au niveau sanguin, au pic (J15) entre les SIC et les singes non-contrôleurs. En revanche, les SIC avaient un niveau d'infection significativement plus faible dans les ganglions dès J15. De même, après 18 mois, les charges ADN SIV apparaissaient plus faibles dans tous les tissus des SIC. Parallèlement, sur le plan immunologique (C. Pereira et al., I. Pasteur), l'activité suppressive des cellules T CD8 spécifiques du SIV s'est développée au cours du temps et était liée à des niveaux de réservoir viral plus faibles (Manuscrit 2). La modélisation mathématique combinant les résultats immuno-virologiques (V. Madelain et al., Paris 7) a montré une décroissance biphasique de l'ADN SIV après le pic de virémie chez les SIC, liée à 2 populations cellulaires (1 à demi-vie courte et 1 à demi-vie longue). Ces résultats indiquent les cellules à cibler dans le contexte des études de rémission et/ou cure (Manuscrit 3). L'ensemble de ces données démontre le rôle clé des tissus lymphoïdes dans la dynamique de l'infection et dans la diffusion des variants viraux. La forte dispersion virale souligne la nécessité d'utiliser des molécules diffusant dans tout l'organisme.

  • Titre traduit

    Quantitative and genetic characterization of Simian Immunodeficiency Virus dynamics in blood and tissues of cynomolgus macaque during natural history


  • Résumé

    Simian Immunodeficiency Virus (SIV) infection persists in the body with infected cells containing the integrated viral genome. These cells called "reservoirs" constitute the major barrier to viral eradication and are focus of interest of new therapeutic challenges. The simian model enables the exploration of tissue reservoirs and viral evolution throughout the whole body. In a first part, the aim of our work was to characterize the dynamics of SIV in the blood and tissues in the absence of treatment. In the P-Visconti program, six macaques were infected by SIVmac251 and were followed 6 months before euthanasia. We developed ultrasensitive assays for the SIV DNA quantification (cell infection level) and cell-associated SIV RNA (caSIV RNA), expressing the transcriptional ability of infected cells. In addition, we developed a high throughput sequencing method and bioinformatics tools for in-depth analysis of more than 60 million reads, describing the evolution and number of viral variants in blood and tissues. We showed that the kinetics of the number of infected blood cells and their transcriptional level reflected the kinetics of plasma viremia. Moreover, the evolution of genetic diversity (number of variants and genetic distance) mimicked the evolution of the two markers. The variants constituting the inoculum tended to disappear as soon as day (D)28 in the plasma but persisted longer in the blood cells. The proportion of major variants evolved over time and, despite identical inoculum, a great heterogeneity of infection levels and genetic diversity could be observed among the monkeys. At 6 months post infection, many tissues were collected at euthanasia. We showed a disseminated and replicative infection over 26 anatomical sites, including skin and adipose tissues. Secondary lymphoid organs exhibited the highest levels of infection and transcriptional activity, which were associated with the most divergent viral quasi-species profiles from the inoculum, highlighting the major role of lymph nodes in the viral evolution. Infection level of many tissues was correlated with that observed in blood at the peak of replication. The different lymphoid tissues and several non-lymphoid tissues shared some major variants, indicating high exchanges of virions and/or infected cells between tissues (Manuscript 1). In a second part, we examined a model of SIVmac infected macaques, and 12 out of 16 animals exhibited spontaneous viral control (Simian "controllers": SIC). No difference of viral level was observed in blood at the peak (D15) between SIC and non-controller macaques. In contrast, SIC had a significantly lower level of infection in the lymph nodes since D15. Moreover, after 18 months, SIV DNA loads appeared lower in all SIC tissues. In addition, immunological studies (C. Pereira et al., I. Pasteur) showed that suppressive activity of SIV-specific CD8+ T cells has been developed over time and was related to lower viral reservoir levels (Manuscript 2). Mathematical modeling combining these immuno-virological data (V. Madelain et al., Univ Paris 7) showed a biphasic decay of SIV DNA after the peak of viremia in SIC, that could be related to 2 cell populations (one with short half-life and the other with a long half-life). These results indicate which cells have to been targeted in the context of remission and/or cure studies (Manuscript 3). All of these data demonstrate the key role of lymphoid tissues in the infection dynamics and in viral variants diffusion and diversification. The strong viral spread highlights the need to use molecules that penetrate throughout the whole body.