Identification de nouveaux facteurs moléculaires impliqués dans la réponse immunitaire contre le virus d'Epstein Barr (EBV) et la réponse proliférative lymphocytaire

par Sarah Winter

Thèse de doctorat en Immunologie

Sous la direction de Sylvain Latour.

Thèses en préparation à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité .


  • Résumé

    L'infection par le virus d'Epstein-Barr (EBV) touche plus de 90% de la population mondiale et est dans la majorité des cas asymptomatique dans l'enfance. Certains individus, souvent à l¿adolescence, développent une primo-infection symptomatique appelée mononucléose infectieuse. L'EBV peut également entraîner chez des individus immunodéprimés des désordres lymphoprolifératifs, des lymphomes ou syndromes d¿activation lymphohistiocytaire. Depuis une trentaine d'années plusieurs déficits immunitaires primitifs entraînant une susceptibilité particulière à l'infection par l'EBV ont été identifiés ; parmi ceux-ci figurent les déficits en SAP, XIAP, ITK, MAGT1, CTPS1, CD27 ou CD70. Leur caractérisation a permis de mettre en évidence de nouveaux mécanismes immunitaires impliqués dans la réponse anti-EBV. L'objectif de ce travail a donc été d'identifier de nouveaux défauts génétiques entraînant une susceptibilité particulière à l'infection par l'EBV. Au sein de deux familles consanguines, trois patients ont développé des lymphomes B liés à l'EBV ainsi que des épisodes de lymphoproliférations également liées à ce virus. Deux mutations homozygotes dans RASGRP1 entraînant un stop prématuré, A638GfsStoXp16 et S314X ont été respectivement identifiées par séquençage d'exome (WES) chez ces deux familles. Sur le plan immunologique ces patients sont caractérisés par une lymphopénie CD4+, un défaut de cellules T naïves, une accumulation de cellules T effectrices mémoires et une absence de cellules MAIT et iNKT. RASGRP1 est une protéine de la famille des facteurs d'échange nucléotidiques fortement exprimée dans les lymphocytes T et NK. Elle active la petite protéine G Ras qui elle-même va activer la cascade des kinases Raf-MEK-ERK (ou cascade des MAP kinases). L'analyse des cellules du patient ou de cellules de contrôles sains dans lesquelles l'expression de RASGRP1 a été inhibée par RNA interférents a permis de mettre en évidence le rôle fondamental de RASGRP1 dans la prolifération lymphocytaire T et l'expression de gènes impliqués dans cette prolifération tels que CTPS1, PCNA ou RECQL4. A l'inverse, RASGRP1 semble être un régulateur négatif du facteur de transcription EOMES impliqué dans la différenciation des lymphocytes T. EOMES est retrouvé surexprimé dans les lymphocytes T en l'absence de RASGRP1, pouvant expliquer le phénotype effecteur mémoire et sénescent des lymphocytes des patients déficients en RASGRP1. Au sein d'une autre famille consanguine, chez deux patients ayant développé une primo-infection à l'EBV symptomatique, dont l'un a nécessité un traitement par anti-CD20 et corticoïdes, a été identifiée une mutation homozygote non-sens dans IL27RA entraînant un codon stop précoce (G96X) et une absence d'expression protéique dans les cellules T des patients. IL-27RA code pour la sous-unité alpha du récepteur à l'IL-27 impliqué dans la prolifération des lymphocytes T et le développement Th1 des lymphocytes CD4+ via la cascade des JAKs/STATs. Dans les lymphocytes T des patients, l'activation de la voie JAK/STAT par l'IL-27 est complètement abolie et l'IL-27 n'augmente pas leur prolifération en réponse à une stimulation anti-CD3 (au contraire des cellules contrôles issues de donneurs sains). De plus, un défaut fonctionnel de la voie Th1 est retrouvé chez un des deux patients. Ces résultats démontrent que la voie dépendante de l'IL-27RA est déficiente chez ces deux patients et que ce défaut génétique rend vraisemblablement compte de leur immunodéficience. La description de ces deux nouveaux déficits immunitaires caractérisés par une susceptibilité à l'EBV a permis de confirmer le rôle fondamental dans l'étape de prolifération et d'expansion des lymphocytes T au cours de la réponse immune anti-EBV, mais également de mettre en évidence de nouveaux mécanismes et facteurs impliqués dans cette étape.

  • Titre traduit

    Identification and characterization of new genetic defects involved in Epstein-Barr virus immune response and T cell proliferation


  • Résumé

    Epstein-Barr virus (EBV) is a gamma-herpes virus that infects 90% of humans without any symptoms in most cases. Some individuals, mostly adolescents, can develop infectious mononucleosis. In immunocompromised individuals, EBV can lead to lymphoproliferative disorders, lymphomas or virus-associated hemophagocytic syndrome. In the past 30 years, several primary immunodeficiencies associated with a high risk to develop EBV-associated disorders have been identified, including SAP, XIAP, ITK, MAGT1, CTPS1, CD27 or CD70 deficiencies. Their characterization has highlighted specific pathways required for efficient immunity to EBV. The objective of this work was to identify new genetic defects associated to a peculiar susceptibility to EBV infection. In two consanguineous families 3 patients developed EBV-associated B cell lymphomas and other EBV-associated lymphoproliferative disorders. By while exome sequencing (WES) we identified two homozygous mutations in RASGRP1 leading to a premature stop codon (A638GfsX16 and S314X). Immunologically these patients presented with CD4+ lymphopenia, low number of naïve T cells and absence of MAIT and iNKT cells. RASGRP1 codes for a diacylglycerol-regulated exchange factor preferentially expressed in T and NK cells, which acts as an activator of the small G protein RAS and the downstream RAF-MEK-ERK kinases cascade (or MAP kinases pathway). Analysis of patients' T cells or control T cells in which RASGRP1 expression was downregulated by short-hairpin RNA technique has highlighted the crucial role of RASGRP1 in T cell proliferation and in the expression of genes known to be involved in cell proliferation or replication such as CTPS1, PCNA or RECQL4. Furthermore, RASGRP1 seems to be a negative regulator of the transcription factor EOMES involved in T cell differentiation. EOMES was found overexpressed in T cells in the absence of RASGRP1. This might explain the skewed effector-memory and exhausted phenotype observed in RASGRP1-deficient patients. In another large consanguineous family two patients developed symptomatic EBV primary infection requiring for one or them anti-CD20 and corticosteroids treatment. Homozygous nonsense mutation leading to a premature stop codon in IL-27RA (G96X) was identified by exome sequencing. No protein expression could be detected in patients' cells. IL-27RA codes for the subunit of IL-27 receptor involved T cell proliferation and Th1 CD4+ development through JAKs/STATs pathway. Stimulation of patients' T cells with IL-27 led to absent JAK/STAT activation pathway and did not enhance their proliferation after anti-CD3 stimulation (contrary to healthy control T cells). Furthermore, Th1 functional defect was found in one patient. These results demonstrate that IL-27RA pathway is deficient is these two patients and that this genetic defect causes their immunodeficiency. Characterization of these two new primary immunodeficiencies associated with a high susceptibility to EBV infection has confirmed the crucial role of T cell proliferation and activation in EBV immune response but has also highlighted new pathways involved in T cell expansion.