Étude de l'hétérogénéité intratumorale génétique et non-génétique du neuroblastome

par Simon Durand

Projet de thèse en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Isabelle Janoueix-Lerosey.

Thèses en préparation à Paris Sciences et Lettres , dans le cadre de Cancérologie : biologie - médecine - santé , en partenariat avec Génétique et biologie des cancers (laboratoire) et de Institut Curie (établissement de préparation de la thèse) depuis le 15-10-2014 .


  • Résumé

    Le neuroblastome (NB) a été premièrement décrit par James Wright en 1910. Il est le cancer pédiatrique extra-crânial le plus fréquent chez l'enfant avec un âge médian au diagnostic de 17 mois. Cette pathologie a pour origine le système nerveux périphérique formé par les cellules de la crête neurale. Son traitement demeure un réel challenge puisque le NB demeure responsable de 15% de la mortalité infantile due au cancer. Deux oncogènes majeurs ont été identifiés dans la pathogénicité du NB. MYCN est trouvé amplifié dans 25% des cas, et des mutations du gène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) sont retrouvées dans 8 à 10% des cas sporadiques de NB. ALK code pour un récepteur transmembranaire à activité tyrosine kinase exprimé préférentiellement pendant le développement du système nerveux central et périphérique. Les points chauds de mutations de ALK en positions F1174, R1275 et F1245 se situent dans le domaine kinase, elles conduisent à son activation et favorisent l'oncogenèse. Le croisement de souris « knock-in » portant une mutation activatrice de Alk avec des souris surexprimant MYCN induit une pénétrance complète et diminue la latence du développement du NB. Dans les lignées cellulaires de NB, l'inhibition de ALK entraine une diminution de la prolifération des cellules mutées pour ALK. L'ensemble de ces observations font de ALK une cible thérapeutique d'intérêt dans le traitement du NB. Jusqu'à présent, la fonction du récepteur ALK dans les cellules de NB a été étudiée par invalidation totale de ALK, c'est-à-dire de la forme sauvage et mutée dans des lignées de NB hétérozygotes pour la mutation ou bien par surexpression d'isoformes spécifiques (mutés ou sauvages) de ALK dans des systèmes hétérologues. De plus, les profils génomiques des lignées de NB différent selon les lignées. Dans ce contexte, la comparaison des propriétés des lignées cellulaires selon leur statut ALK est donc difficile à réaliser. Récemment, l'apparition de mutations de ALK ont été documenté à la rechute. De plus, des mutations à un état sous-clonal ont été observées dans certains cas, au diagnostic et à la rechute, démontrant la présence d'une importante hétérogénéité au sein d'une même tumeur. Cependant, l'impact de de ces mutations sous-clonale de ALK sur l'oncogenèse et l'évolution tumorale du NB reste inconnu. Dans les tumeurs de patients, il a été précédemment montré que les profils transcriptomiques dans les tumeurs possédant une forte expression de ALK sauvage sont fortement similaires à ceux des tumeurs ALK mutées et corrèlent avec un pronostic défavorable. Il a également été montré que les tumeurs ALK mutées présentent une expression plus importante de l'ARNm ALK plus important que les tumeurs ALK sauvages. A notre connaissance, il n'y a jusqu'à présent jamais eu de données transcriptomiques générées au niveau cellule unique dans le NB. L'objectif de ce projet de these et d'explorer de manière spécifique la fonction et les propriétés du récepteur ALK muté en comparant des celluels de NB ayant commme unique différence la présence ou non de la mutation ALK. Nous étudierons son impact sur le phénotype, le transcriptome et l'épigénome des cellules de NB. Nous souhaitons également comprendre comment l'hétérogénéité tumorale contribue à l'oncogenèse et l'évolution de la tumeur. L'interaction entre les cellules mutées et sauvages pour ALK sera également étudié afin de déterminer leur rôle dans le développement tumoral et s'il peut-exister une coopération entre ces deux types de cellules comme cela est le cas dans certains cancers. Enfin, l'hétérogénéité intra-population de cellules mutées ou non pour ALK sera appréciée au niveau du transcriptome de cellules uniques. Nous déterminerons si les cellules mutées et sauvages montrent une variabilité d'expression de ALK, et ces données nous permettrons d'étudier de nombreux autres axes, tels sur le pattern d'expression globale des cellules exprimant fortement ALK contre des cellules ne l'exprimant que faiblement. Pour répondre à ces questions, nous avons utilisés des stratéhgies d'édtion du génome par CRISPR-Cas9 afin de générer des lignées isogénique ALK mutées et ALK sauvages. En parallèle, nous utilisons à notre avantage deux lignées de NB issues du même patient, l'une établie à partir de la tumeur primaire (PT) et l'autre à partir de la moelle envahie (BM). Ces deux lignées présentent une mutation activatrice de ALK (F1174L) à différent pourcentages.

  • Titre traduit

    From intratumor genetic and non-genetic heterogeneity to plasticity in neuroblastoma


  • Résumé

    Neuroblastoma (NB) was first described by James Wright in 1910. It is the most common extracranial solid pediatric cancer with a median age at diagnosis of 17 months and a prevalence of 1/10 000 birth. This disease arises from the sympathetic nervous system formed by the neural crest cells3. The treatment of NB remains a therapeutic challenge since NB cases still account for 15% of childhood cancer mortality4. Two main oncogenes, MYCN and ALK, have been identified as major actors of NB pathogenesis. MYCN amplifications are observed in 25% of cases and ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) mutations are found in 8% of sporadic NB cases5–8. The ALK gene encodes a transmembrane receptor tyrosine kinase preferentially expressed during the development of the peripheral and central nervous systems. Evidences indicated that the observed ALK point mutations, occurring mainly at three hotspots at positions F1174, R1275 and F12459, are kinase-activating and promote oncogenesis. Crossing knock-in mice bearing Alk activating mutation with mice over-expressing MYCN induces a full penetrance and diminishes the latency of NB development10. In NB cell lines, ALK inhibition leads to a decreased proliferation in ALK mutated cells, thus placing ALK as a tractable therapeutic target in NB11. Until now, the function of the ALK receptor in NB tumor cells has been investigated by invalidation of total ALK, i.e., wild-type (WT) and mutated ALK in NB cell lines with heterozygous mutations or by overexpression of specific forms (WT or mutated ALK) in heterologous systems. Also, the genomic landscapes of NB cell lines differ across different samples. In this context, the comparison of the properties of cell lines according to their ALK status is difficult to achieve. Recently, new ALK mutations have been shown to emerge in some patients at relapse13. In addition, subclonal mutations have also been documented in some cases at diagnosis and at relapse14, revealing a high degree of genetic heterogeneity among cells of a given tumor. However, the impact of sub-clonal mutations to oncogenesis and the contribution of the ALK mutated subclone to tumor evolution remain largely unknown. In NB patients, at the global tumor level, it has previously been shown that the transcriptomic profiles of tumors with high-level expression of WT ALK were highly similar to the ones of ALK mutated tumors and correlate with an unfavorable prognosis15. It was also shown that tumors with ALK mutations exhibited an elevated ALK mRNA expression level in comparison with tumors bearing WT ALK. To our knowledge, the transcriptomics data in NB have never been generated at a single cell level. The aim of this project is to explore specifically the function and properties of the mutated ALK receptor by comparing NB cells bearing or not ALK mutation as a sole difference. We will investigate its specific impact on phenotype, transcriptome and epigenome of NB cells. We also aim to decipher how tumor heterogeneity contributes to tumor evolution. The interplay between ALK mutated and ALK WT cells among the same tumor will be studied and we will investigate whether some cooperation between these two cell types occurs during tumor development and progression as it has been shown in other cancers 16,17. Finally, the intra-population heterogeneity of both cell types will be assessed at single cell RNA level. We will determine whether cells with or without an ALK mutation exhibit variability in the ALK mRNA expression level. Several axes will be study, among them the global expression pattern of cells presenting with the highest ALK WT expression level will be compared to that of ALK mutated cells. In order to answer these questions, we planned to use a genome engineering strategy to obtain isogenic NB cell lines presenting or not the ALK mutation as a unique difference. In parallel, we took advantage of two neuroblastoma cell lines derived from a stage 4 patient at diagnosis, either from the primary abdominal tumor (PT) or from the bone marrow (BM) and bearing an ALK mutation at different percentages.