Caractérisation des ARN hélicases liées aux maladies humaines

par Joanne Kanaan

Projet de thèse en Génomique

Sous la direction de Hervé Le hir.

Thèses en préparation à Paris Sciences et Lettres , dans le cadre de Complexité du vivant , en partenariat avec Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure (laboratoire) et de Ecole normale supérieure (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2014 .


  • Résumé

    LES ARN et ADN hélicases sont des enzymes ubiquitaires retrouvées dans tous les organismes, et plusieurs mutations qui affectent leur fonctionnement sont responsables de maladies mortelles. Les hélicases sont des moteurs moléculaires qui déroulent et remodèlent les complexes acides nucléiques - protéines en utilisant l'énergie libérée par l'hydrolyse de l'ATP. Upf1 humaine est une 5'3' ARN et ADN hélicase hautement régulée, connue surtout pour son role indispensable au sein du "Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD)", voie cellulaire nécessaire à l'élimination des ARN messagers aberrants. Grace à l'utilisation des pinces magnétiques, notre laboratoire a récemment montré que le domaine hélicase d'Upf1 humaine présente une activité hélicase et translocase extrêmement processive sur l'ARN et l'ADN. Est-ce que cette processivité est unique à Upf1 humaine? Afin de répondre à cette question, nous avons utilisé les pinces magnétiques pour tester l'homologue d'Upf1 chez la levure, ainsi qu'une autre hélicase de la meme famille qu'Upf1. Nous avons ainsi pu montrer la conservation de la processivité entre les Upf1 de différents organismes, et la perte de cette processivité dans le cas de l'autre hélicase. Nous avons ainsi caractérisé ces enzymes à differents niveaux afin d'expliquer les différences observées. Dans une deuxième partie du projet, nous avons voulu évaluer l'importance de la processivité d'Upf1 au sein d'un modèle vivant. Pour ce faire, nous avons généré des mutations d'Upf1 qui réduisent sa processivité dans nos essais, et nous les avons testé in vivo chez la levure. Les analyses des résultats sont actuellement en cours.

  • Titre traduit

    Characterisation of RNA helicases linked to human diseases


  • Résumé

    RNA and DNA helicases are ubiquitously found in all organisms and several of their mutations are responsible for life-threatening diseases. These energy dependent molecular motors unwind nucleic acid duplexes and remodel and assemble nucleic acid-protein complexes. Human Upf1 (Up-frameshift 1) is a highly regulated 5' to 3' RNA and DNA helicase, mostly known as one of the core proteins of Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD). Using magnetic tweezers, our lab recently showed that helicase domain of human Upf1 is an extremely processive helicase and translocase both on RNA and DNA substrates at a single molecule level. The processivity of monomeric human Upf1 was estimated to more than 10 kb, a value comparable to the multimeric Escherichia coli DNA helicase RecBCD involved in DNA repair. Is this processivity unique for human Upf1? In order to answer this question, we used magnetic tweezers to study the S. cerevisiae homolog of Upf1, and a second helicase belonging to the Upf1-like family. Using purified recombinant proteins, we show that ScUpf1 helicase domain shares very similar characteristics with its human homolog in processivity and affinity to substrate, yet presents a higher speed which could be explained by faster ATP hydrolysis rates. On the other hand, the Upf1-like helicase we chose does not present any unwinding activity in its helicase core alone, while the full length form is a functional helicase that works in small bursts of unwinding with low processivity. These differences in processivity compared to Upf1 correlate with different affinities for substrate that we observe in binding assays, and in subtle structural variations that we are currently investigating. We also investigated the importance of Upf1 processivity in vivo using S.cerevisae as a model. To do so, we designed and tested mutations that reduce the processivity of Upf1. In vivo results are currently being analyzed.