Organisation et fonction de nanodomaines subcellulaires révélés par l'analyse statistique de trajectoires de particules uniques.

par Pierre Parutto

Thèse de doctorat en Sciences cognitives option Neurosciences computationnelles

Sous la direction de David Holcman.

Thèses en préparation à Paris Sciences et Lettres , dans le cadre de École doctorale Cerveau, cognition, comportement (Paris) , en partenariat avec Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure (laboratoire) et de École normale supérieure (Paris ; 1985-....) (établissement opérateur d'inscription) .


  • Résumé

    Les trajectoires de molécules individuelles obtenues par microscopie super-résolution révèlent le mouvement des protéines avec une précision nanométrique dans des cellules vivantes. Dans les neurones, elles ont permis de comprendre la contribution des molécules à la dynamique synaptique. Extraire des informations de trajectoires requiert un modèle stochastique qui est souvent difficile à construire à cause de l'hétérogénéité des nanodomaines cellulaires. Dans la première partie de cette thèse, j'ai caractérisé les nanodomaines de haute densité observés dans les trajectoires. J'ai utilisé comme modèle la description du mouvement de Langevin avec un champ de force local exprimé comme le gradient d'une fonction d'énergie. Ce modèle permet de calculer des quantités qui ne sont pas directement accessibles comme la hauteur de la barrière de potentiel ou le temps de résidence des molécules dans le puits. Pour estimer les caractéristiques géométriques des bords, j'ai développé une méthode qui combine la densité des points et le champ de force et ai évalué ses performances vis-à-vis d'approches classiques par maximum de vraissemblances via des simulations de Monté Carlo. Dans la seconde partie, j'ai utilisé cette nouvelle méthode pour caractériser en tant que puits de potentiels les nanodomaines de haute densité apparaissant dans deux variantes d'épissage des canaux calciques voltage dépendants CaV2.1: CaV2.1+47/CaV2.1∆47 (avec/sans queue C-terminale) sur la membrane de neurones hippocampaux. J'ai trouvé que ces nanodomaines ont des tailles ≈ 80nm, localisés au niveau des zones actives des terminaux présynaptiques et stabilisent les canaux pour ≈ 100ms, beaucoup plus longtemps que par pur diffusion. De plus, les puits sont très dynamiques et durent ≈ 30s, compatibles avec la redistribution des CaV après la fusion de vésicules synaptiques aux zones actives. Finalement, cette analyse associée avec des enregistrements electrophysiologiques et de l'imagerie calcique / glutamique dans diverses conditions suggère que la redistribution des CaV modèle la probabilité de relâche et la plasticité synaptique à court terme de chaque synapse. Dans la troisième partie, j'ai analysé des trajectoires de calreticuline dans le lumen du Réticulum Endoplasmique (RE). J'ai trouvé que les régions de haute densité corrèlent avec les jonctions du réseau du RE périphérique. Pour interpréter cette dynamique luminale, j'ai d'abord développé une méthode pour construire un modèle de graphe du RE à partir de trajectoires grâce auquel j'ai proposé un modèle stochastique du mouvement où les particules alternent entre diffusion confinée au niveau des jonctions et sauts à haute vitesses dans les tubules. De plus, l'analyse du graphe a révélé que le contenu luminal peut visiter le réseau entier, que le réseau est à l'équilibre et que les tubules possèdent des périodes d'alternance dans la direction du flot. Cette étude montre la présence d'un flot actif dans le lumen du RE qui serait un mécanisme efficace d'homogénéisation du calcium sur de longues distances. Dans la dernière partie, je discute de possibles extensions des méthodes présentées pour : 1. le trafic des lysosomes interagissant avec le réseau du RE, 2. la dynamique des CaV au niveau des jonctions neuromusculaires chez la drosophile et 3. l'estimation de différents modes de mouvement du complexe remodeleur de chromatine NuRD. En conclusion, cette thèse introduit des modèles stochastiques pour reconstruire la dynamique moléculaire vis-à-vis des processus fondamentaux de nanophysiologie qui ont lieu dans les neurones et pouvant être étendus à beaucoup d'autres types cellulaires.

  • Titre traduit

    Statistical analysis of single particle trajectories reveals sub-cellular nanodomain organisation and function


  • Résumé

    Single-Particle Trajectories (SPTs) recorded at super-resolution reveal protein motion with a ten of nanometers precision in living cells. In neurons, SPTs have revealed how molecules contribute to synaptic dynamics. However extracting information from SPTs requires a stochastic model, which is often difficult to construct due to the heterogeneity of cellular nanodomains. In the first part of the thesis, I characterized the high-density nanodomains revealed by SPTs. I used as a model the Langevin description with a local field of force expressed as the gradient of an energy function. This model allows computing quantities that are not directly recorded from trajectories, such as the height of the energy barrier or the residence time of a molecule inside the well. To estimate the geometrical characteristics of potential wells' boundaries, I developed a method combining point density and vector-field. The performances of this method are evaluated using Monte Carlo simulations and compared with classical maximum-likelihood approaches. In the second part, I used this new method to characterize high-density nanodomains as potential wells for two splice variants of the CaV2.1 voltage-gated calcium channels: CaV2.1+47 / CaV2.1∆47 (with/without C-terminal tail), imaged on the membrane of hippocampal neurons. I found that these nanodomains have sizes ≈ 80nm, localized at presynaptic terminal's active zones and can stabilize channels for ≈ 100ms, much longer than pure diffusion. In addition, the wells are highly dynamic with a mean time of ≈ 30s, compatible with the redistribution of CaV following synaptic vesicle fusion events at active zones. Finally, this analysis in conjunction with electrophysiological recordings and calcium/glutamate imaging under various conditions suggested that CaV redistribution shapes the release probability and short-term plasticity at individual synapses. In the third part, I analyzed SPTs of calreticulin in the Endoplasmic Reticulum (ER) luminen. I found that high-density regions correlated with tubular junctions of the peripheral ER network. To interpret the luminal dynamics, I first developed a method to construct a graph model of the ER from SPTs and then proposed a stochastic model of motion where particles can switch between confined diffusion at junctions and transient high-velocity jumps in tubules. The recovered ER graph also revealed that the moving material can visit the entire network. Finally, I found that the network is at equilibrium and tubules exhibit periods of alternating flow direction. Overall, this study shows the presence of an active flow in the ER lumen that provides a possible efficient mechanism for calcium homogenization over long distances. In the final part, I discussed possible extensions of the present methods for 1. lysosome trafficking interacting with the ER network, 2. CaV dynamics at neuromuscular junctions of drosophila and 3) estimating different modes of motion of the NuRD chromatin remodeling complex. To conclude, this thesis introduces stochastic models to reconstruct the molecular dynamics with respect to fundamental nanophysiology processes occurring in neurons and could be extended to much more types of cells.