influence du cisplatine et du complexe NTS/NTSR1 sur la réponse thérapeutique aux immunothérapies anti PD-1/PD-L1 dans les carcinomes broncho-pulmonaires non à petites cellules

par Ludovic Fournel

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Patricia Forgez.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé (Villejuif, Val-de-Marne) , en partenariat avec Homéostasie Cellulaire et Cancer (laboratoire) , Homeostasie Cellulaire et Cancer (equipe de recherche) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 21-11-2016 .


  • Résumé

    Introduction Le cancer broncho-pulmonaire représente la première cause mondiale de mortalité liée au cancer avec 1,4 millions de décès en 2008 . Il s'agit, dans 85% des cas, de carcinomes bronchiques non à petites cellules (CBNPC) alors que les 15% restants sont des carcinomes neuroendocrines à petites cellules. On peut regrouper les cancers de stades précoces (0, Ia-b, IIa), les stades intermédiaires opérables (IIb, IIIa), les stades intermédiaires non ou marginalement opérables (IIIb) et les stades métastatiques (IV), représentant respectivement 14,5%, 17,8%, 9,5% et 58,3% des malades au moment du diagnostic. Le traitement des CBNPC de stades précoces repose principalement sur la chirurgie d'exérèse alors que celui des stades métastatiques est un traitement systémique correspondant le plus souvent à de la chimiothérapie et dans des cas particuliers à des thérapeutiques ciblées. Plus récemment, se sont développés dans le CBNPC les « immune check-point inhibitors ». Il s'agit d'anticorps dirigés contre des check point immunitaires et qui interrompent la voie de signalisation médiée par PD1 (programmed death 1-receptor). PD-1 est un récepteur exprimé sur les lymphocytes T présents dans le microenvironnement immunitaire tumoral et son ligand est PDL-1. A l'état physiologique l'activation de cette voie permet de diminuer l'autoimmunité. Or, PDL-1 est souvent exprimé par des cellules tumorales, à des niveaux variables, dans le CBNPC ou d'autres cancers solides. L'idée initiale, a été de bloquer ce couple PD-1/PDL-1 afin de restaurer l'immunité de l'hôte contre la tumeur. Les immunothérapies sont en plein essor car elles présentent l'avantage de cibler des tumeurs de manière moins restrictive que les thérapies ciblées, toutefois la caractérisation de sous populations de patients dont la survie serait significativement améliorée par les anti-PD-1/PDL-1, ainsi que leurs modalités d'utilisation et interactions avec d'autres traitements restent à définir. Résultats des traitements et facteurs pronostics: Malgré les progrès réalisés dans la détection et le traitement du CBNPC, le taux de survie à 5 ans, est de 17% tous stades et toutes histologies confondus et descend jusqu'à 4% pour les malades de stade IV. Les malades traités par chirurgie représentent la population au pronostic le plus favorable avec une survie à 5 ans de l'ordre de 50% variable selon le stade. Le bénéfice démontré du traitement multimodal sur ces malades « chirurgicaux » est significatif mais reste modeste. Concernant les patients de stades plus avancés, traités par thérapie systémique, les faibles taux de survie rapportés montrent qu'un plateau a été atteint en termes de bénéfice thérapeutique. Outre le stade TNM, différents facteurs pronostiques ont été identifiés: - les facteurs pronostics liés à la tumeur qu'ils soient histologiques, phénotypiques ou moléculaires(altérations génétiques). - Les facteurs liés à l'hôte et à son immunité comme la C-reactive protein ou le statut nutritionnel du malade. - Les facteurs liés à l'interaction entre hôte et tumeur, notamment le rôle du microenvironnement immunitaire (organisation des cellules dendritiques matures et des lymphocytes CD8+, expression PD-1/PDL-1) ou l'influence des différents traitements reçus sur la tumeur et son microenvironnement. C'est pourquoi il semble intéressant d'évaluer l'impact de potentielles cibles moléculaires au sein de cohortes de patients ayant eu une prise en charge chirurgicale à un moment donné du traitement multidisciplinaire. Couple NTS/NTSR1 résultats acquis par l'équipe et préliminaires au projet Des études rétrospectives réalisées sur des cohortes de malades « chirurgicaux » opérés dans notre centre et, dont les données complètes seront disponibles pour ce projet, ont permis de mettre en évidence que : - L'expression de NTSR1 représentait un marqueur de mauvais pronostic indépendant des critères cliniques d'évaluation usuellement utilisés (cohorte de 140 malades opérés pour adénocarcinome stade I). - la forte expression du NTSR1 est associée à un mauvais pronostic seulement dans le type histologique adénocarcinome (basé sur une cohorte de 271 patients avec un CBNPC réséqué chirurgicalement). - NTS/NTSR1 influence la sensibilité au Cisplatine de CBNPC sur des modèles cellulaires et de xénogreffes tumorales. Le développement d'un Anticorps anti NTS a permis d'affiner et d'améliorer les résultats. En effet, Les anticorps monoclonaux anti-NTS ont été testé d'une part sur une lignée de CBNPC très agressive, et d'autre part sur deux modèles de PDX (patients derived xenograph). Dans ces trois modèles, les anticorps seuls diminuent la croissance tumorale et la formation de métastases. En combinaison avec le Cisplatine, ils amélioraient largement (3 fois) la cytotoxicité et la réponse tumorale (Annexes figure 1). stimulation neurotensinergique et le microenvironnement immunitaire Les cohortes de malades « chirurgicaux » décrites précédemment, ont permis de mettre en évidence les résultat préliminaires suivants : la surexpression de NTSR1 par les cellules des tumeurs réséquées chirurgicalement est significativement associée à une diminution de nombres de cellules dendritiques matures dans le microenvironnement immunitaire (p=0.022) et il existe une corrélation inverse entre le niveau d'expression protéique de NTSR1 et le pourcentage de cellules tumorales exprimant PDL-1 (p=0.023). Ce résultat, corrobore les données obtenues à partir des études de transcriptome disponibles dans la Base TCGA. Dans une cohorte de 504 patients présentant un CBNPC le z-core d'expression de l'ARNm de PDL-1 est inversement corrélé avec celui du NTSR1 ou de la NTS, p=0.015 et p= 0.001 respectivement). Cette corrélation inverse a été vérifiée par analyse in vitro qui a montré que l'inhibition de l'activation du système neurotensinergique augmente l'expression de PDL-1. Ces résultats préliminaires suggérant une interaction entre NTS/NTSR1, microenvironnement immunitaire tumoral, ont été confirmés dans un modèle de cellules de carcinome ovarien, les cellules SKOV3. Dans ce modèle, exprimant NTS et de manière plus ténue NTSR1 que les cellules LNM-R, l'inhibition de la voie neurotensinergique par un antagoniste spécifique du NTRS1, influence également l'expression de PDL-1 (48h traitement). Lorsque les cellules sont exposées au carboplatine, le niveau de l' ARNm de PDL-1 est amplifié, cette amplification est encore exacerbée par l'antagoniste du NTSR1 (Annexes figure 3). Programme de recherche 1) Interactions NTS-NTSR1 / microenvironnement immunitaire : Analyse de cohortes chirurgicales. Le premier volet du projet sera clinico-pathologique avec une analyse de données épidémiologiques, cliniques, histologiques, immunohistochimiques, moléculaires et pronostiques sur les cohortes de patients chirurgicaux ayant déjà fait l'objet d'études et de publications préalablement citées soit sur le système neurotensinergique soit sur le microenvironnement immunitaire dans les CBNPC opérés. 1a) NTS/NTSR1 et microenvironnement immunitaire Tester les interactions entre l'activation du système neurotensinergique et le microenvironnement immunitaire. Ceci sera attesté sur les pièces de résection de CBNPC de stade précoce (I et II), avec évaluation du niveau d'expression neurotensinergique en immunohistochimie, puis étude de l'infiltration immunitaire tumoral (CD8, mDC, Treg…) 1b) NTS/NTSR1 er expression PD-1/PDL-1 Tester la corrélation entre l'activation du système neurotensinergique (de la même façon que détaillé au paragraphe précédent) et l'expression de PDL-1 évaluée par pourcentage de cellules tumorales exprimant PDL-1 en immunohistochimie sur des patients traités par chirurgie première. 1c) Interactions dans le cas des malades de stade IIIa Tester les mêmes interactions (paragraphes 1-2), mais cette fois ci sur des cohortes de malades de stade clinique cIIIa dont la plupart ont reçu traitement à base de platine en induction. Cette analyse se fera par mesure de ces différents critères sur deux types de tissus infiltrés par la tumeur (poumon, ganglions N2) 1d) NTS et microenvironnement immunitaire pour des malades de stade IV Analyser sur une cohorte de patients avec un CBNPC de stade IV ayant eu une biopsie chirurgicale dans le service d'une localisation métastatique, permettant l'analyse des deux systèmes NTS/NTSR1 et PD-1/PDL-1. Cette expression sera notamment analysée en fonction de la réponse à la chimiothérapie de première ligne comportant du Cisplatine. Il s'agit, entre autre, de démontrer que les patients présentant une tumeur exprimant fortement NTSR1 ont une moins bonne réponse au Cisplatine que ceux à faible expression NTSR1 et également d'attester d'une influence des deux systèmes étudiés. Nous chercherons donc à démontrer, dans cette première partie, qu'il existe des interactions entre NTS/NTSR1 et microenvironnement immunitaire à la fois sur le plan cellulaire et sur le plan de l'expression PD-1/PDL-1, cible de thérapies en plein essor actuellement dans le CBNPC. 2) NTS et réponse tumorale aux sels de platine et aux immunothérapies Le deuxième volet du Projet consiste à caractériser l'influence du couple NTS/NTSR1 sur la sensibilité, de CBNPC, au Cisplatine et aux antis PD-L1. Nous aborderons cette question en cherchant à démontrer, in vitro et in vivo, la relation existant entre voie de signalisation neurotensinergique, check-point immunitaires et processus cellulaires connus pour interférer dans la réponse tumorale au Cisplatine. 2a) NTS et anti-PD-L1 Nous chercherons à montrer, modèle syngénique de Lewis modifié28, que l'activation du système NTS/NTSR1 influence la réponse aux anti-PDL-1, comme le suggère les premiers résultats obtenus cliniquement sur les cohortes de malades opérés, ou lors des expériences préliminaires. Ils permettront de mettre en évidence les effets additionnels ou synergiques avec le traitement anti NTS et anti-PDL-1 sur la progression tumorale. 2b) NTS et sels de platine L'amplification de la réponse aux sels de platine par la NTS a été démontrée dans des modèles cellulaires très agressifs résistant au cisplatine et deux modèles d'adénocarcinome de poumon PDX PT2N0 et PT2N1. Ces effets doivent être également démontrés sur des modèles moins agressifs comme les cellules A-459 qui répondent partiellement aux sels de platine. Objectifs: montrer l'impact du cisplatine et du couple NTS/NTSR1 sur l'expression de PD-L1 Montrer l'impact du blocage de NTS/NTSR1 et du traitement par cisplatine sur l'efficacité des immunothérapies anti PD-1/PD-L1 dans des modèles de greffes syngéniques de tumeurs pulmonaires de souris. Confirmer ces résultats sur des séries cliniques chirurgicales Perspectives: améliorer des thérapeutiques pré existantes (cisplatine), développer des thérapeutiques (Ac anti NTS) et définir des populations cibles pour optimiser la réponse tumorale aux thérapeutiques mises en œuvre (modalité d'administartion des immunothérapies pour les patients amenés à être traités par Cisplatine)

  • Titre traduit

    impact of cisplatin and NTS/NTSR1 complex on the effectiveness of anti PD-1/PD-L1 immune therapies in non small cells lung carcinomas


  • Résumé

    Lung carcinoma is the world leading cause of caner related death (1.4M/year. Despite improvements in its treatment, prognosis remains unfavorable with poor survival rates (5-year survival of 4% in overall stage 4 non small cell lung carcinoma. Last-years, new therapies have been developed: immune therapies, anti PD-1/PD-L1 antibodies, in particular. The PD-1/PD-L1 pathway is called an immune check-point that tends to adapt the immune response. This pathway is used in different cancer types, lung and melanoma in particula, to escape the host anti-tumor immunity. Indeed, tumor cells express PD-L1 and interact with immune cells of the microenvironment (dendritic cells, T lymphocytes) and down-regulate their ability to lead to cancer destruction. Immune therapies as anti PD-1 or anti PD-L1 aim to restore the anti tumor activity by blockade of this pathway.Beside TNM staging, other factors are known to influence tumor prognosis and response to treatments: - Tumor-linked factors (mutation, histologic and pathological type...) - interaction linked factors (immune micro-environment, treatments'influence...) In this project, we will mostly explore this kind of factors and the influence of neurotensin and cisplatin treatment on the PD-1/PD-L1 immune check point and response to specific immune therapies. - host-linked factors (inflammation, nutritional status,Performans status...) preliminary results to the project: We previously found in our team that: - in vitro,after treatment with cisplatin of an agressive lung cancer cell line (LNM-R),transcriptional level (ARNm) of PD-L1 expression was significantly increased (p=0.0023). - In surgical cohort of operated patients for treatment of an early stage adenocarcinoma of the lung, there was a significant reverse correlation between NTSR1 and PD-L1 expressions (immunohistochemistry). - in vitro and in vivo (xenograft model): blockade of NTS/NTSR1 pathway increased tumor sensitivity to platinum-based chemotherapy. Methods of the project: - In vitro,confirm the increase of PD-L1 expression when cell lines are treated with cisplatin. We will characterize sub populations of cells from a Lewis models (further used in vivo in syngeneic tumor grafts of mice) and assess their NTS/NTSR1/PD-L1 expression status. Then we will evaluate and compare expression levels of PD-L1 in different conditions (control, treatment with cisplatin alone, Ab anti-NTS alone, cisplatin+Ab anti-NTS...). Expression of PD-L1 will be evaluated at the transcriptional (PCR) and translational (Western blot) levels. - Then we will inject these previously characterized cell lines to mice ) in order to perform syngeneic tumor grafts.We will establish different groups of treatment and evaluate/compare tumor growth and metastatic potential in each group (control,tratment with cisplatin, Ab anti-NTS, cisplatin + Ab anti PD-L1...). At the end of the treatment we will perform a resection of the primary tumor and associated lymph nodes in order to analyze the immune micro-environment (CD8, dendritic cells...). - In a surgical cohort of patients operated for treatment of stage IIIa non small cell lung carcinoma, we will compare PD-L1 expression levels (immunohistochemistry) before and after treatment with platinum based neo-adjuvant chemotherapy. - We will also try to confirm our preliminary results obtained in patients treated with first intention surgery,analyzing an enlarged cohort of resected adenocarcinomas in which we will perform assessment of PD-L1 and NTS/NTSR1 expressions in immunohistochemistry. Perspectives are the development of an anti NTS targeted therapy that could improve sensitivity to both platinum-based chemotherapy and anti PD-1/PD-L1 immune therapy.Furthermore, it would be important therapeutically to demonstrate an impact of Cisplatin on PD-L1 expression in tumor cells and their sensitivity to immune therapies.