Impact de l'inflammation sur les réponses immunitaires muqueuses au sein du tractus reproducteur féminin

par Cindy Adapen

Projet de thèse en Immunologie

Sous la direction de Elisabeth Menu.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Centre de recherche en immunologie des infections virales et des maladies auto-immunes (laboratoire) et de université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-02-2017 .


  • Résumé

    Les muqueuses du tractus reproducteur féminin (TRF) sont l'une des portes d'entrée principales des infections sexuellement transmissibles (IST). Le TRF est composé de cinq compartiments qui sont : le vagin, le col de l'utérus, l'utérus, les trompes de Fallope et les ovaires. Le col de l'utérus est composé de l'endocol et de l'exocol qui ont une architecture différente. Ainsi, l'endocol, comme l'utérus, est tapissé d'un épithélium monostratifié, tandis que l'exocol, comme le vagin, a un épithélium pluristratifié squameux. Chaque compartiment possède une distribution spécifique en cellules immunitaires (innées et adaptatives). Les cellules épithéliales et immunitaires participent à la défense contre les infections en sécrétant, entre autres, des chimiokines et des cytokines pro et anti-inflammatoires. Cette production est régulée par les récepteurs membranaires ou intracellulaires de l'immunité innée et des hormones. Le microbiote présent au sein du TRF participe également à la régulation de la réponse immunitaire. Le TRF est le plus souvent colonisé, chez la femme en bonne santé, par des bactéries de la famille des lactobacilli qui permettent le maintien d'un pH acide, d'un environnement peu inflammatoire ainsi que la défense contre les infections en produisant des composés bactériostatiques et bactéricides (comme H2O2). Le remplacement des lactobacilli par des bactéries anaérobies obligatoires ou facultatives telles que Gardnerella vaginalis entraîne un changement d'une flore normale vers une flore en dysbiose ou une vaginose bactérienne. Une dysbiose chez la femme favorise les IST. Contrairement à l'homme, les macaques rhésus femelles ne possèdent pas une flore à prédominance lactobacilli et se rapprocheraient davantage d'une flore en dysbiose. Concernant les macaques cynomolgus, notre équipe d'accueil est en train de caractériser leur flore. Le sperme est un des vecteurs principaux des STI. C'est un liquide biologique complexe composé d'une fraction cellulaire et acellulaire. Il contient de nombreux composants pouvant inhiber ou augmenter l'infection des muqueuses du TRF. Ces composants induisent, entre autres une augmentation du pH et une inflammation, favorisant le recrutement de leukocytes. L'inflammation, bien que nécessaire à la clearance des pathogènes peut, si elle n'est pas contrôlée, constituer un facteur de risque contre les IST telle que Chlamydia trachomatis ou VIH-1. Chlamydia trachomatis (CT) est l'agent responsable du développement d'une IST bactérienne, la plupart du temps asymptomatique pouvant néanmoins évoluer vers une inflammation chronique responsable de plusieurs séquelles telle que la stérilité. Cette IST est prédominante chez les femmes de 14 à 24 ans et ne cesse d'augmenter depuis une quinzaine d'années. De nombreuses études ont démontré que l'infection par CT serait responsable d'une susceptibilité accrue à l'infection VIH-1 dans le tractus reproducteur féminin. Les sérovars D-K de CT sont des bactéries intracellulaires obligatoires infectant de façon préférentielle l'épithélium monostratifié du tractus génital supérieur, dont les cellules de l'endocol et de la zone de transformation (zone où l'épithélium pluristratifié se transforme en couche monostratifié) correspondent aux cellules cibles de l'infection. CT engendre une infection à long terme (persistance de la bactérie) favorisant les infections répétées, et menant à une susceptibilité accrue à d'autres pathogènes telle que le VIH-1. De plus, l'endocol est considéré comme point d'entrée de l'infection VIH-1, ce qui suggère une probable interaction entre ces deux pathogènes. Chlamydia est responsable d'une inflammation entraînant un recrutement de cellules cibles du VIH-1 dont l'expression de cytokines contribuerait à la réplication du VIH-1. De même, le développement d'abrasions au sein de l'épithélium de l'endocol faciliterait l'accès du VIH-1 aux cellules ciblent comme les cellules CD4+. L'objectif de ce projet de thèse est de déterminer l'impact de l'environnement muqueux sur les co-infections CT/VIH-1 au sein du tractus reproducteur féminin. En effet, dans le contexte où des femmes infectées par CT sont exposées au VIH-1, nous étudierons le rôle des facteurs de l'environnement sur la susceptibilité à l'infection VIH-1 et sur les réponses immunitaires innées et adaptatives locales. Parmi les facteurs de l'environnement, nous nous intéresserons plus spécifiquement à ceux qui modulent l'inflammation au niveau local. Nous étudierons la susceptibilité à l'infection VIH-1 et les réponses immunitaires locales par différentes approches in vitro, ex vivo et in vivo. Pour les expériences in vitro, nous utiliserons des cellules de l'endocol humaines (lignée A2EN, laboratoire d'A. Quayle) ou simiennes (lignée à établir). Dans un premier temps, nous mettrons au point un modèle en chambre double, dont la chambre supérieure sera composée de cellules épithéliales de l'endocol polarisées infectées ou non par CT, et la chambre inférieure de cellules isolées des différents compartiments du TRF (Trompes et col de l'utérus) humains ou simiens. Les cellules isolées du tractus reproducteur (femme ou macaque) seront mises en présence de différents facteurs de l'environnement puis exposées au VIH-1. Grâce à une collaboration avec des cliniciens de l'hôpital Bicêtre, nous pourrons obtenir des explants des différents compartiments du TRF humain. Le modèle de primates non humains (macaques cynomolgus) est développé dans le laboratoire d'accueil et nous pourrons ainsi obtenir en complément des explants de TRF simien. Les différents facteurs de l'environnement étudiés seront les suivants : des Lactobacilli (environnement peu inflammatoire), des Gardnerella (environnement inflammatoire modéré) et enfin du liquide séminal (forte inflammation). La quantification de l'infection VIH-1 sera faite par ELISA antigène p24 ou ICS, les cytokines pro/anti-inflammatoires, chimiokines et marqueurs de l'inflammation et d'activation seront analysés (Luminex, microscopie confocale, immunohistochimie ou immunofluorescence). Nous validerons la pertinence de ce modèle in vitro en confirmant, dans un premier temps, que l'infection par CT favorise l'infection et la transmission du VIH-1. Dans un second temps nous pourrons établir si les facteurs de l'environnement induisent une inflammation supplémentaire à celle induite par CT, et si ils ont un impact sur la susceptibilité à l'infection VIH-1 ainsi que sur les réponses immunitaires associées. L'approche ex vivo consistera à récupérer les surnageants de cellules épithéliales (lignée cellulaire ou cellules primaires) infectées ou non par CT puis de les déposer sur des explants de TRF humain ou simien stimulés ou non par les facteurs de l'environnement suivis d'une exposition au VIH-1. Les approches expérimentales seront les mêmes que celles développer pour le modèle in vitro. Finalement, nous testerons in vivo la pertinence des résultats obtenus in vitro et ex vivo à l'aide du modèle de primates non humains chez des femelles macaques cynomolgus. Celles-ci seront infectées par CT en cervico-vaginal puis exposés aux facteurs de l'environnement, et infectés par SIV. Nous suivrons la susceptibilité à l'infection SIV ainsi que les réponses immunitaires innées et spécifiques anti-chlamydia et anti-VIH-1 en systémique (sang et ganglions) et dans les différents compartiments muqueux du TRF. L'ensemble de ces expériences nous permettra de mesurer les réponses immunitaires muqueuses induites lors de co-infections CT/VIH-1 ou SIV mais aussi de comprendre le rôle des facteurs de l'environnement sur la susceptibilité à l'infection VIH-1 dans le contexte d'une infection à CT préexistante. Ce projet donnera des informations importantes à prendre en considération pour l'optimisation des réponses vaccinales contre les IST et le développement d'interventions au niveau du TRF afin de préserver ou d'induire un environnement sain.

  • Titre traduit

    Inflammation-induced effects on mucosal immune responses within the female reproductive tract


  • Résumé

    Heterosexual transmission from male to female is the major route of STI transmission and occurs via the mucosas from the female reproductive tract (FRT). Mucosal immunity in the FRT is affected by physiological and sexual events, such as hormonal cycle, sexually transmitted infections (STIs) or semen exposure. Semen is the main vector of transmission. It is a complex biological fluid with a cellular and acellular fraction. In several species, including human, it has been shown that non-infected seminal fluid induces leukocyte recruitment, expression of proinflammatory cytokines, activation of innate and adaptive immune events in a sequence that resembles an inflammatory response in the FRT. The FRT microbiota might also modulate the local immune responses. Imbalance in the microbial community (dysbiosis) can lead to bacterial vaginosis and inflammatory environment. Such alterations of FRT microbiota are associated with a higher risk of HIV/STIs infections. Chlamydia trachomatis, a sexually transmitted bacterium is predominantly asymptomatic, but generally inflammatory that can cause severe reproductive sequelae. CT is the most common STI among women ranging between 14 and 24 years old. It is associated with an increased risk of HIV-1 acquisition and increases viral shedding in the female genital tract (FGT). Serovar D-K are an obligate intracellular bacterium and the endocervical epithelial cells provide the major niche for this bacterium in women. It is also a tissue in which HIV transmission can occur. However, the mechanism by which CT infection enhances HIV susceptibility at this site is not well understood. Some hypothesis could be as follows: induction of inflammation leads to the recruitment of HIV-1 target cells, the cytokines production of these cells increased HIV-1 replication and shedding. The aim of this project is to ascertain the impact of mucosal environmental on HIV-1/CT co-infections in the FGT. In the context of CT infected women exposed to HIV-1: we will study the impact of environmental factors on the susceptibility of HIV-1 infection and on the local immune responses (innate and specific). We will focus particularly on environmental factors involved in the modulation of inflammation We will study the susceptibly of HIV-1 infection and local immune responses using different approaches: in vitro, ex vivo and in vivo. For in vitro experiments, we will mainly use human endocervix cells (A2EN generated in Dr Alison Quayle lab) or simian (needs to be established). Firstly we will develop a double chamber experiment, in the apical chamber we will add CT-infected or non infected A2EN and in the basolateral chamber primary cells extracted from human or simian FGT compartments (fallopian tubes, cervix). Primary cells will be stimulated or not with different environmental factors, to induce a varying inflammatory response, and then exposed to HIV-1. These factors are: bacterium from the lactobacilli family (weak inflammation), bacterium from the gardnerella family (moderate inflammation) and semen (strong inflammation). Quantification of HIV-1 infection will be controlled by p24 ELISA or ICS and cytokines, chemokines, activation and inflammatory markers will be measured by luminex (or IHC/IHF). The in vitro model will be validated by demonstrating that CT infection increases HIV-1 infection. We will then analyze whether environmental factors increase the inflammation induce by CT and if they increase susceptibility to HIV-1 infection. Their impact on immune responses will also be studied. For ex vivo experiments we will collect the supernatants of CT-infected or non infected epithelial cells. These supernatants will be added to human or simian FGT explants previously exposed to environmental factors or not, followed by an HIV-1 exposure. The methods will be identical to the ones develop for the in vitro experiments. We will then perform in vivo experiments to test the relevance of our results. Female cynomolgus macaques will be infected with CT, stimulated or not with environmental factors and then exposed to SIV. The susceptibility to SIV infection will be followed as well as the systemic and mucosal innate and specific immune responses (anti-SIV and anti-CT). Altogether, these experiments will allow to have a better understanding of the susceptibility to infections and the mucosal immune responses during CT/HIV-1 co-infections according to the local environment. This should give important informations to be taken into account for vaccine optimization against STIs and for the development of intervention to preserve or induce an healthy FGT environment.