Confirmation de biomarqueurs pronostic du sepsis et développement de tests rapides

par Christelle Dubois

Projet de thèse en Chimie

Sous la direction de François Becher et de Nathalie Morel.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Sciences Chimiques : Molécules, Matériaux, Instrumentation et Biosystèmes , en partenariat avec Service de pharmacologie et d'immuno analyse (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-12-2016 .


  • Résumé

    Le sepsis est la 3eme cause de mortalité dans les pays occidentaux, avec un taux de mortalité entre 20 et 50% selon la sévérité. La « prédiction » du devenir clinique du patient est essentielle pour établir le traitement le plus adéquat. Quelques protéines marqueurs de l'inflammation ou d'une infection (CRP, procalcitonine) sont citées pour le suivi des patients en clinique mais manquent de spécificité pour le sepsis. D'autre part, les études « omiques » ont permis de générer des listes de biomarqueurs potentiels du pronostic vital du sepsis. En revanche, aucun n'a encore été validé et/ou confirmé en fonction de la gravité du sepsis et du devenir du patient. Il faut pour cela accéder non seulement à des cohortes de patients parfaitement caractérisées et également disposer de méthodes quantitatives robustes et validées. La MS apporte une capacité de spécificité et de multiplexage à haut niveau et permettrait de confirmer et valider l'intérêt d'une ou plusieurs de ces protéines dans le cas du pronostic du sepsis. Les dosages immunologiques apportent quant à eux en plus de la sensibilité et de la spécificité, une mise en œuvre en routine clinique simple et rapide. Les objectifs du projet sont 1) d'établir une liste de biomarqueurs identifiés avec des cohortes de patients, à partir des données omiques (étude bibliographique), 2) de développer des méthodes de détection et de quantification de ces biomarqueurs par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse impliquant ou non une étape d'immunopurification 3) de développer, pour les marqueurs les plus discriminant, des tests immunologiques rapides (ELISA et test bandelette) 4) de valider ces tests avec des cohortes pertinentes de patients avant de les mettre à disposition des cliniciens. Méthodologie : Une liste de 30-50 biomarqueurs potentiels sera tout d'abord établie à partir des données bibliographiques. Un premier criblage de détection dans des plasma sera réalisé pour juger de la capacité de détection de ces protéines par MS (en ciblant une liste de peptides tryptiques représentant l'ensemble des protéines identifiées). Pour les protéines non détectées lors de ce criblage, une méthode d'immunopurification sera développée à l'aide d'anticorps polyclonaux anti-peptides produits au laboratoire. Les méthodes MS multiplexées seront validées puis appliquées à des cohortes de patients caractérisées pour vérifier la pertinence des candidats biomarqueurs. Ce travail se réalisera en étroite collaboration avec le service de réanimation de l'hôpital Lariboisière, dirigé par le Pr Didier Payen. Cette équipe a en outre récemment identifié par transcriptomique un nouveau marqueur potentiel du pronostic vital, les calgranulines S100A8/A9. Un dosage ELISA a confirmé l'intérêt de cette protéine avec deux cohortes de patients, mais demande à être confirmer. Il s'agira ici de proposer une quantification précise tenant compte de la grande hétérogénéité de la protéine (présence d'homodimères , hétérodimères et de modifications post-traductionnelles). La MS permettra de caractériser finement les différentes isoformes puis d'identifier lesquelles seraient de potentiels marqueurs du pronostic du sepsis dans des prélèvements de sang de patients dont l'issue clinique est connue. Pour les biomarqueurs les plus pertinents identifiés, des anticorps monoclonaux seront produits et des tests rapides multiparamétriques de pronostic du sepsis seront mis au point et validés avec différentes cohortes de patients.

  • Titre traduit

    Confirmation of prognostic biomarker of sepsis and development of rapid tests


  • Résumé

    Sepsis is the 3rd leading cause of death in Western countries, with a mortality rate between 20 and 50% depending on the severity. The 'prediction' of the patient's clinical outcome is essential to establish the most appropriate treatment. Some protein markers of inflammation or infection (CRP, procalcitonin) are cited for the monitoring of clinical patients but lack specificity for sepsis. On the other hand, omics studies have generated lists of potential biomarkers of life-threatening sepsis. However, none have been validated and / or confirmed depending on the severity of sepsis and patient outcome. This requires not only access to patient cohorts perfectly characterized but also robust and validated quantitative methods. MS provides specificity and capacity for high level multiplexing and would confirm and validate the usefulness of one or more of these proteins in prognosis of sepsis. Immunoassays provide, for their part, in addition to the sensitivity and the specificity, a quick implementation and easy clinical routine. The project objectives are 1) to establish a list of biomarkers identified from omics data (literature study), 2) to develop methods of detection and quantification of these biomarkers by liquid chromatography mass spectrometry involving or not an immuno-purification step 3) to develop, for the most discriminating markers, rapid immunoassays (ELISA and test strips) 4) to validate these tests with relevant patient cohorts before to make them available to clinicians. Methodology : A list of 30-50 potential biomarkers will first be established from bibliographic data. A first detection screening in plasma will be carried out to judge the detection capacity of these proteins by MS (targeting a list of tryptic peptides representing all identified proteins). For undetected proteins during this screening, an immunopurification method will be developed using anti-peptide polyclonal antibodies produced in the laboratory. MS multiplexed methods will be validated and then applied to a well-characterized patient's cohort to verify the relevance of candidate biomarkers. This work will be carried out in close collaboration with the intensive care unit of the hospital Lariboisière, headed by Professor Didier Payen. This team has also recently identified, using transcriptomics, a potential new marker of prognosis, the calgranulins S100A8 / A9. ELISA has confirmed the interest of this protein using two cohorts of patient samples, but needs to be confirmed. This will aim to provide a precise quantification by taking into account the heterogeneity of the protein (presence of homodimers, heterodimers and post-translational modifications). MS will allow characterizing finely the different isoforms and then identifying which one would be a potential prognosis marker of sepsis in patient's blood samples whose clinical outcome is known. For the most relevant biomarkers identified, monoclonal antibodies will be produced and rapid multiparametric prognostic test of sepsis will be developed and validated using different cohorts of patients.