Caractérisations biochimiques des protéines à répétitions de dipeptides et de leurs assemblages

par Laurent Brasseur

Projet de thèse en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Ronald Melki et de Luc Bousset.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Signalisations et Réseaux Intégratifs en Biologie , en partenariat avec Neuro-PSI - Institut des Neurosciences Paris Saclay (laboratoire) et de université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-09-2016 .


  • Résumé

    La répétition de nucléotides (GGGGCC)n est le facteur génétique le plus présent chez les patients atteints de démence fronto-temporale (DFT) familiale et de sclérose latérale amyotrophique (SLA), elle apparait au niveau du cadre de lecture ouvrant 72 du chromosome 9 (C9orf72). La DFT se caractérise par des troubles de la personnalité, du langage et du comportement causés principalement par une dégénérescence de neurones corticaux, thalamiques, hippocampiques et cérébelleux tandis que les patients SLA sont atteints de paralysie des muscles squelettiques causée par la mort de motoneurones au niveau de la moelle épinière. Ces deux pathologies partagent de nombreuses caractéristiques cliniques et génétiques, suggérant qu'il existe des mécanismes communs entre elles. D'abondantes inclusions cytoplasmiques de protéines issues de la traduction des ARNs C9orf72 ont été retrouvé dans le cerveau de patients décédés de SLA et de DFT (Mori et al 2013). Ces protéines comportent de nombreuses répétitions de dipeptides (DRPs) : glycine-alanine (GA), glycine-proline (GP), glycine-arginine (GR), proline-arginine (PR) et proline-alanine (PA). La toxicité de ces DRPs a été mis en évidence dans des modèles cellulaires (Iovicic A et al 2015, Wen X et al 2014, Kwon I et al 2015, Zhang YJ et al, 2014) et chez la Drosophile mélanogaster (Mizielinska S. et al 2014). Cependant peu d'études se sont concentrées sur la caractérisation biochimiques de ces DRPs (Chang YJ et al. 2016, Ivanova et al. 2016). Le travail de cette thèse consiste en la reproduction et la caractérisation in-vitro des protéines DRPs impliquées dans la Sclérose Latérale Amyotrophique et la Démence fronto-temporale. Je réaliserais la caractérisation biochimique de ces protéines et étudierais leurs capacités à s'auto-assembler au sein de l'équipe « Repliement des protéines in vitro et maladies conformationnelles » dirigée par Ronald Melki. Les DRPs recombinants de plusieurs longueurs seront produits et nous déterminerons les conditions in-vitro dans lesquelles ces protéines s'assemblent. Les cinétiques d'assemblage seront suivies à l'aide de traceurs (Thioflavin T, Rouge Congo…). La morphologie des agrégats obtenue sera aussi étudiée par microscopie électronique. Nous nous intéresserons à l'influence du nombre de dipeptides présent dans un DRP sur sa capacité à s'agréger. La toxicité et la capacité de ces DRPs à être internalisés sera testées dans des modèles cellulaires en collaboration avec l'équipe du Pr. Mimoun Azzouz de l'Université de Sheffield.

  • Titre traduit

    Biochemical caracterisations of dipeptides repeat proteins and their assemblies


  • Résumé

    The most common genetic factor between familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Frontotemporal Dementia (FTD) is the repetition of (GGGGCC)n in the open reading frame 72 of chromosome 9 (C9orf72). FTD is characterized by personality, behavior and language disorders due to neuronal degeneration in the cortex, thalamus, hippocampus and cerebellum. ALS patients, on the other hand, exhibit motor symptoms primarily consisting of paralysis of the skeletal muscles caused by motoneuronal loss in the spinal cord. These pathologies have significant genetic and clinic overlaps suggesting common mechanisms. Large amounts of cytoplasmic inclusions of the Dipeptide Repeat Proteins (DRPs), translated from C9orf72 RNA, were found in brains of patients who died from ALS or FTD (Mori et al 2013). These proteins are constituted of repetitions of Dipeptides : glycine-alanine (GA), glycine-proline (GP), glycine-arginine (GR), proline-arginine (PR) and proline-alanine (PA). The toxicity of the aggregated DRPs has been shown in various cellular models (Iovicic A et al 2015, Wen X et al 2014, Kwon I et al 2015, Zhang YJ et al 2014) as well as in Drosophila melanogaster (Mizielinska S. et al 2014). Nevertheless, few studies have described the biochemistry of the DRPs (Chang YJ et al. 2016, Ivanova et al. 2016). The aim of my thesis is the in-vitro caracterization of the DRPs implicated in ALS and FTD. I will characterize the biochemistry of these proteins and in particular their self-assembly abilities in Ronald Melki's team « Proteins folding and conformational diseases ». Recombinant DRPs of different lengths and nature will be produced to determined the in-vitro conditions in which they assemble. I'll follow the kinetics of assembly by using chemical tracers (Thioflavin T, Red Congo…). The morphology of these aggregates will be studied by transmission electron microscopy. I'll also focus on the importance of the number of dipeptide repetitions in the aggregation process. Lastly, the toxicity and internalization of these proteins and their assemblies will be tested on culture cells in collaboration with Pr. Mimmoun Azzouz of the University of Sheffield.