Etude de l'hémostase et de l'endothelium chez des patients atteints de maladie congénitale de glycosylation (CDG)

par Tiffany Pascreau

Projet de thèse en Physiologie, physiopathologie

Sous la direction de Delphine Borgel et de Delphine Borgel.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Inserm U 1176 - Hémostase, Inflammation, Thrombose (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-12-2016 .


  • Résumé

    Les CDG (congenital disorder of glycosylation) sont des maladies rares caractérisées par un déficit enzymatique à l'origine d'un défaut dans le processus de glycosylation. L'anomalie la plus fréquemment observée est lié au déficit en phosphomannomutase 2 (PMM2). Cette enzyme intervient dès les premières étapes de la glycosylation puisqu'elle convertit le mannose-6 phosphate en mannose-1 phosphate, dans le cytosol. La diminution d'activité de PMM2 entraîne un déficit quantitatif global de glycosylation à la surface des protéines. Les patients sont diagnostiqués très tôt et présentent soit une atteinte neurologique pure avec un retard psychomoteur, une hypoplasie cérébelleuse, un strabisme, soit une forme multiviscérale avec atteinte cardiaque, hépatique, rénale, ou encore gastro-intestinale1. En plus de ces atteintes, des évènements vasculaires aigus peuvent survenir dans l'enfance. Ces évènements sont en majorité des « stroke-like » et plus rarement des hémorragies ou des thromboses. Les « stroke-like », comme leur nom l'indique, ne traduisent pas d'ischémie comme dans les véritables accidents vasculaires cérébraux et ne respectent donc pas le territoire artériel. Ils sont dans la plupart des cas transitoires et sans séquelles. De plus, ils surviennent toujours au décours d'un épisode fébrile sans qu'une infection ne soit documentée2,3. Un des stigmates biologiques des CDG est une perturbation des protéines de la coagulation. On observe souvent une diminution des facteurs de la coagulation, notamment les facteurs IX et XI mais aussi une diminution des inhibiteurs de la coagulation comme l'antithrombine, la protéine C et la protéine S4. Le défaut combiné de protéines procoagulantes et d'inhibiteurs de la coagulation entraîne une instabilité du système hémostatique global. A ce jour le profil global de coagulation n'a jamais été étudié chez ces patients, et aucune corrélation n'a été établie entre la survenue des épisodes de « stroke-like » et les anomalies de l'hémostase observées. D'autre part, la physiopathologie des « stroke-like » sont mieux décrits dans un autre syndrome métabolique, le syndrome MELAS (mitochondrial encephalopathy lactic acidosis and stroke-like episodes), dans lequel la dysfonction mitochondriale serait à l'origine d'une perturbation de l'homéostasie ionique ou d'une instabilité membranaire conduisant, entre autre, à une augmentation de la perméabilité capillaire associée à un œdème. Dans le PMM2-CDG, la dysfonction mitochondriale étant absente, d'autres mécanismes pourraient être à l'origine d'un défaut de perméabilité et de l'apparition d'un œdème, parfois décrit dans le CDG. De plus, compte tenu du déficit en protéine C observé chez les patients CDG et de l'activité protectrice bien décrite du système de la protéine C sur la barrière endothéliale, nous avons émis l'hypothèse qu'un dysfonctionnement du système de la protéine C pourrait participer à la physiopathologie des stroke-like.5 Les objectifs de la thèse sont de : 1- Générer une lignée stable de cellules endothéliales issues de la microcirculation cérébrale (hCMEC/D3)5 inactivée pour le gène PMM2 par une méthode de transfection par shARN. a- Etudier les caractéristiques de barrière de ces cellules inactivées pour PMM2 par rapport aux cellules contrôles à l'aide de méthodes d'étude de la barrière endothéliale (test de perméabilité endothéliale au bleu d'Evans, mesure d'impédance en temps réel : technique iCELLigence®). Ces essais seront réalisés en condition basale et en condition de stimulus inflammatoire (TNFα, IL-1) ou de température (40°C) afin de mimer le contexte du « stroke-like ». b- Etudier le système de la protéine C à la surface de ces cellules : mesure de la capacité des cellules à générer de la protéine C activée à leur surface (test de génération de protéine C activée), évaluation de l'expression des récepteurs impliqués dans le système de la protéine C (Endothelial protein C receptor : EPCR, Protease activated receptor 1 : PAR1 et Thrombomoduline : TM) par cytométrie en flux et immunofluorescence et quantification des ARNm de ces récepteurs en RT-qPCR. 2- Reproduire l'ensemble de nos expérimentations sur des cellules endothéliales issues de patients atteints de CDG, les progéniteurs endothéliaux circulants (PECs) isolés à partir de sang périphérique comparé à des PECs isolés à partir de sujets sains. Dans le cadre de cette recherche interventionnelle chez ces patients CDG, un protocole sera rédigé puis soumis au CPP pour autorisation de cette recherche. 3- Caractériser la balance hémostatique de ces patients qui présentent des déficits à la fois en facteurs de la coagulation et en inhibiteurs par le test de génération de thrombine. Ce test sera rendu particulièrement sensible au système de la protéine C par addition de thrombomoduline soluble qui permet de mobiliser le système de la protéine C. Les plasmas de patients seront comparés à des plasmas témoins appariés en âge et en sexe. L'ensemble des facteurs de la coagulation seront dosés en parallèle sur ces plasmas en activité et antigène afin d'observer l'impact du défaut de glycosylation des facteurs sur l'activité coagulante ou anticoagulante de ces protéines. De plus le profil de glycosylation des protéines de la coagulation impactées sera étudié en électrophorèse en gel 2D. Bibliographie 1 P de Lonlay and al, A broad spectrum of clinical presentations in congenital disorders of glycosylation I: a series of 26 cases, J Med Genet 2001;38:14-19 2 Jaeken, Carchon H, The carbohydrate-deficient glycoprotein syndromes: an overview. J Inherit Metab Dis. 1993; 16(5):813-20. 3 Arnoux, J. B. et al. Risk assessment of acute vascular events in congenital disorder of glycosylation type Ia. Mol. Genet. Metab. 93, 444–449 (2008). 4 Chris Van Geet and Jaak Jaeken, A unique pattern of coagulation abnormalities in carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome, Pediatric research, Vol. 33, No. 5, 1993 5 Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V. & Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood 109, 3161–3172 (2007) 6 Weksler, B. B. et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. (2005).

  • Titre traduit

    Study of haemostasis and endothelium among patients with congenital disorder of glycosylation (CDG)


  • Résumé

    The congenital disorder of glycosylation (CDG) or carbohydrate deficient glycoprotein syndrome are rare metabolic diseases characterized by an enzymatic deficiency in the glycosylation process. Phosphomannomutase 2 (PMM2) deficiency is the most frequent of the congenital disorders of glycosylation named PMM2-CDG. PMM2 catalyses the transformation of mannose-6-phosphate to mannose-1-phosphate in the first steps of N-glycosylation process. PMM2 deficiency results in quantitative defect of N-glycan chains attached on proteins. PMM2-CDG patients present a broad clinical spectrum but we can distinguish two subtypes of PMM2-CDG: the first one is a neurological form with psychomotor retardation, strabismus, cerebellar hypoplasia, and retinis pigmentosa, and the second one is a multivisceral form with neurological and extraneurological features as cardiac, renal, liver or gastrointestinal involvement1. In childhood, the disease is punctuated with acute vascular events, which occurred in patients younger than 15 years, especially during fever and prolonged immobilization whereas any infections are documented2. The literature review reports many cases of stroke-like (transient cerebral vascular accident) which are the most frequent neurological complication. Less frequently, thrombosis and haemorrhages were also identified.3 The hallmark biochemical feature is a carbohydrate deficiency in a large number of serum glycoprotein. Because coagulation factors and inhibitors are also glycosylated, they are often affected in CDG patients. Moreover a pattern of coagulation abnormalities has been well identified in these patients. Indeed, clotting factors FIX and FXI and coagulation inhibitor factors, especially antithrombin, protein C, and protein S are usually decreased4. These observations suggest that coexistence of hypocoagulable and procoagulant factors may create an imbalance between hemorrhagic and thrombotic risk in CDG patients. Nowadays any correlation has been established between the occurrence of “stroke-like” events and the coagulation abnormalities. On the other hand, the physiopathology of stroke-like episodes are better described in another metabolic disease: the Mitochondrial Encephalopathy Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (MELAS) syndrome. In MELAS, mitochondrial dysfunction may be the origin of ionic homeostasis perturbation or membrane instability that leads the increase of capillary permeability and the occurrence of edema. In CDG, there is no mitochondrial dysfunction, that's why another mechanisms may explain the permeability impairment and the edema. Moreover, considering the decrease of protein C among patients and its cytoprotective effects on the endothelial barrier, we suppose that the dysfunction of the protein C system may play a role in the physiopathology of the “stroke-like” events.5 Aims : 1- Generate an endothelial cell line (hCMEC/D3)6 using shRNA to knockdown PMM2 in order to: a- Study the endothelial barrier phenotypic features (permeability assay with Evans blue, impedance assay in real time : iCELLigence® technology). These assays will be conducted in a basal, pro-inflammatory (TNFα, IL-1) or heat (40°C) condition. b- Study of protein C system : by measuring cell capacity to generate activated protein C on their surface (activated protein C generation assay) and by evaluating the level of expression of receptors involved in the protein C system (Endothelial protein C receptor : EPCR, Protease activated receptor 1 : PAR1 et Thrombomodulin : TM) in flow cytometry and immunofluorescence staining. Moreover mRNA of the receptors will be quantified by RT-qPCR. 2- Replicate all the experiments previous described on endothelial primary cells isolated from peripheral blood of patients and healthy donors i.e the progenitor endothelial cells (PECs). This study will be conducted after approval from the French Ethic Committee. 3- Assessment of haemostatic balance among CDG patients who presenting both procoagulant and anticoagulant factor deficiencies. The thrombin generation assay will allow us to evaluate the global coagulation profile because it takes into account both procoagulant and anticoagulant factors. By adding soluble thrombomodulin in this assay, the protein C is mobilized, so that all the inhibitors of the coagulation will be explored. Patients will be compared to controls matched in age and sex. Activity and antigenic measurements will be performed for all the coagulation factors. Thus we may study the impact of the glycosylation impairment on the coagulant or anticoagulant activity of the protein. Moreover, the glycosylation profile of these proteins will be characterised in 2D electrophoresis. Bibliography 1 P de Lonlay and al, A broad spectrum of clinical presentations in congenital disorders of glycosylation I: a series of 26 cases, J Med Genet 2001;38:14-19 2 Jaeken, Carchon H, The carbohydrate-deficient glycoprotein syndromes: an overview. J Inherit Metab Dis. 1993; 16(5):813-20. 3 Arnoux, J. B. et al. Risk assessment of acute vascular events in congenital disorder of glycosylation type Ia. Mol. Genet. Metab. 93, 444–449 (2008). 4 Chris Van Geet and Jaak Jaeken, A unique pattern of coagulation abnormalities in carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome, Pediatric research, Vol. 33, No. 5, 1993 5 Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V. & Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood 109, 3161–3172 (2007) 6 Weksler, B. B. et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. (2005).