Rôle de la protéine ATM dans la régulation des gènes de latences du virus d'Epstein-Barr (EBV)

par Moussab Tatfi

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Olivier Hermine.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé (Villejuif, Val-de-Marne) , en partenariat avec Laboratoire des mécanismes cellulaires et moléculaires des troubles hématologiques et implications thérapeutiques (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-09-2015 .


  • Résumé

    Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est un virus largement répandu dans les populations humaines, avec une prévalence supérieure à 90%. Il est à l'origine de la mononucléose infectieuse, infection bénigne du jeune adulte mais il peut aussi être la cause de proliférations malignes lymphocytaires ou épithéliales chez l'immunodéprimé et plus rarement chez le sujet sain. Bien qu'il soit le plus puissant agent immortalisant in vitro, l'expression de ses gènes viraux est étroitement contrôlée dans les cellules infectées par des mécanismes de régulation cellulaire et par l'immunité cellulaire induite au cours de l'infection. Le virus est maintenu dans les lymphocytes B sous forme épisomale et dans une phase de latence. Il existe 4 phases de latences en fonction des gènes viraux exprimés. Les latences de type III et II contribuent à la prolifération des lymphocytes B activés après infection, mais le virus persiste dans les lymphocytes B mémoires circulants exprimant une latence restreinte (latence de type I et 0). L'ataxie-télangiectasie (AT) est une maladie autosomique récessive caractérisée par une mutation biallélique du gène ATM. Les patients atteints d'AT présentent une ataxie cérébelleuse progressive, des télangiectasies, une sensibilité accrue aux infections et un risque augmenté de cancers notamment de lymphomes hodgkiniens et non-hodgkiniens. Les lymphomes survenant chez les patients avec AT sont fréquemment associés à l'EBV. Bien qu'un déficit immunitaire puisse être associé à l'AT, la majorité des patients ne présentent pas d'infections opportunistes, témoignant de l'absence de déficit cellulaire profond. Ceci suggère que le défaut de fonction d'ATM chez les patients avec AT pourrait s'accompagner d'un contrôle anormal de l'expression des gènes de l'EBV et favoriser les propriétés oncogéniques du virus dans les lymphocytes B infectés. 1°) Dans un premier temps, nous testerons l'hypothèse que le défaut fonctionnel de la protéine ATM favorise la latence virale. Pour étudier le rôle d'ATM dans la régulation des gènes de latence de l'EBV, nous analyserons l'expression des gènes de latence dans des lignées lymphoblastoïdes B issues de donneurs sains (contrôle) et de patients avec AT. Le programme de latence sera analysé en situation basale et après stimulation par des molécules connues pour induire le cycle lytique comme les esters de phorbols (PMA, TPA), la ionomycine, ou l'engagement de l'immunoglobuline de surface. Cette analyse se fera par RT-PCR quantitative à l'aide d'amorces spécifiques et de sondes fluorescentes, par immunofluorescence confocale, en AMNIS stream et par Western Blot pour étudier et quantifier l'expression et la localisation des protéines de latence dans les cellules. 2°) Dans un deuxième temps nous testerons l'hypothèse que dans les cellules de patients AT les protéines de réparation de l'ADN sont anormalement exprimées au cours de l'infection EBV. Dans les modèles utilisées en 1°), nous étudierons l'expression des principales protéines cellulaires impliquées dans la réparation de l'ADN dont une grande partie est normalement régulée par ATM et . Nous analyserons donc en situation d'infection latente et d'infection lytique de l'EBV (après induction du cycle lytique (PMA, Ionomycine, engagement des immunoglobulines)), dans un contexte d'ATM fonctionnelle (cellules contrôles) et dans un contexte d'ATM muté (cellules de patients atteints d'AT) les protéines de réparation. En accord avec cette hypothèse, nous analyserons dans les mêmes conditions que les anomalies d'expression des protéines de réparation s'accompagnent d'une augmentation de cassures de l'ADN par la quantification des focis H2AX. Nous testerons dans ce contexte si cet effet est amplifié après traitement par H202 (induction de ROS). 3°) Dans un troisième temps nous testerons l'hypothèse que les mutations d'ATM favorisent la survenue de mutations au cours de l'établissement de lignées Infectées par l'EBV. Nous infecterons des lymphocytes B de patients AT et témoins par le virus EBV pour constituer des lignées immortalisées. Au cours de ce processus nous analyserons la fréquence des mutations par NGS et analyserons si les lignées AT présentent des différences qualitatives et quantitatives de mutations. En parallèle, sur les mêmes lignées nous établirons un profil transcriptomique. En utilisant plusieurs lignées nous établirons si il existe un profil mutationnel et d'expression d'ARNs particuliers en fonction des profils de latence et des mutations d'AT. En particulier nous analyserons si certaines protéines de la latence protègent les cellules de l'apoptose et de la sénescence induite par l'activation d'oncogènes ou l'inhibition d'anti-oncogènes. 4°) Dans le service d'hématologie nous avons récupérés en rétrospectifs de l'ADN de patients atteints de lymphomes. Nous étudierons en NGS si in vivo les lymphomes EBV ou non EBV chez les patients AT présentent un profil mutationnel particulier en comparant leur profil mutationnel entre eux en fonction de la latence virale et avec leur contrepartie AT non mutés. Nous analyserons si les profils observés in vivo sont identiques à ceux observés à ceux in vitro étudiés en 3°) ou s'il existe des différences en partie liées à la pression du système immunitaire in vivo. Au total de projet permettra de mieu x comprendre les mécanismes de la lymphomagénèse liée au virus EBV chez les patients AT et devrait permettre d'apporter des éclaircissements sur la transformation virale et d'explorer de nouvelles pistes thérapeutiques dans les lymphomes AT et dans les lymphomes asscociés aux virus et associés à des déficits des protéines de réparation de l'ADN.

  • Titre traduit

    Role of the ATM protein in the regulation of Epstein-Barr virus (EBV) latencies genes


  • Résumé

    Epstein-Barr (EBV) virus is widelyspread in human populations, with a greater than 90% prevalence. It is the cause of infectious mononucleosis, a benign infection in young adults but it can also be the cause of lymphocyte or epithelial malignancies in immunocompromised patients and more rarely in healthy subjects. Although it is the most powerful immortalizing agent in vitro, the expression of its viral genes is tightly controlled in the cells infected by cellular regulatory mechanisms and cellular immunity against virus protein induced during the infection. The virus is maintained in B lymphocytes in episomal form and in a latent phase. There are four phases of latencies based on the expression of viral genes. Type III and type II latencies contribute to the proliferation of activated B cells after infection, but the virus persists in the memories circulating B lymphocytes expressing a restricted latency (latency type I and 0). Ataxia telangiectasia (AT) is an autosomal recessive disease characterized by biallelic ATM gene mutations. Patients with AT show a progressive cerebellar ataxia, telangiectasia, increased susceptibility to infections and increased risk of cancer including Hodgkin's and non-Hodgkin lymphoma. Lymphomas occurring in patients with AT are frequently associated with EBV. Although an immune deficiency may be associated with AT, the majority of patients do not present with opportunistic infections, reflecting the absence of deep cellular deficit. This suggests that the ATM defect in patients with AT could be accompanied by an abnormal control of expression of EBV genes that may promote oncogenic properties of the virus in infected B lymphocytes. 1) First, we will test the hypothesis that the functional defect of the ATM protein promotes viral latency. To study the role of ATM in the regulation of EBV latency gene, we will analyze the expression of the latency genes in B lymphoblastoid cell lines from healthy donors (control) and patients with AT. The latency program will be analyzed in basal conditions and after stimulation with molecules known to induce the lytic cycle as phorbols esters (PMA, TPA), the Ionomycin, or the engagement of the surface immunoglobulin. This analysiswill be done by quantitative RT-PCR using specific primers and fluorescent probes, confocal immunofluorescence in AMNIS stream and by Western blotting to investigate and quantify the expression and localization of latency proteins in cells. 2) In a second step we will test the hypothesis that in the cells of AT patients the DNA repair proteins are abnormally expressed during EBV infection. In the models used in 1), we will study the expression of key cellular proteins involved in DNA repair, much of which is normally regulated by ATM . We will therefore analyze in a situation of EBV latent and lytic infection (after induction of lytic cycle (PMA, Ionoomycine, immunoglobulins engagement)), in a context of functional ATM (control cells) and in a context of ATM mutated (patient cells with AT) repair proteins. Consistent with this hypothesis, we will analyze in the same conditions whether or not abnormalities of expression of repair proteins are accompanied by an increase in DNA breaks by quantifying H2AX focis. We will test in this context whether this effect is amplified after treatment with H202 (induction of ROS). 3) Thirdly we will test the hypothesis that ATM mutations favor the occurrence of mutations in establishing lines Infected EBV. We will infect B lymphocytes of AT and control patients by the EBV to generate immortalized lymphoblastoid lines. During this process we will analyze the frequency of mutations and will analyze by NGS if AT cell lines have qualitative and quantitative differences with respect to genes mutations. In parallel, on the same lines we will perform a transcriptomic profile. Using several lines we will establish if there is a mutation profile and expression of specific RNAs based on latency profiles and AT mutations. In particular we will analyze whether some proteins of latency protect cells from apoptosis and senescence induced by the activation of oncogenes or inhibition of anti-oncogenes. 4) In the hematology department of Necker hospital we recovered retrospective DNA from lymphoma patients. We will examine in NGS whether or not in vivo EBV positive or EBV negative lymphomas in AT patients present a particular mutational status. In addition, we will compare the mutational status with their counterpart non-mutated for AT. We will analyze if the in vivo observed patterns are similar to those observed in vitro in 3) or if there are differences in part related to the pressure of the immune system in vivo. Overall, the project will allow a better understanding on the mechanisms of lymphomagenesis linked to EBV virus in AT patients and is expected to bring clarification on viral transformation and to explore new therapeutic approaches in AT lymphoma and lymphomas associated with viruses and deficits in DNA repair proteins.