Caractérisation des assemblages non-covalent de PrPSC

par Jan Bohl

Projet de thèse en Chimie

Sous la direction de Guillaume Van der rest.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Sciences Chimiques : Molécules, Matériaux, Instrumentation et Biosystèmes , en partenariat avec Laboratoire de Chimie Physique (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    Le cœur de ce travail de thèse est centré sur l'utilisation de méthodes biostructurales (spectrométrie de masse, chromatographie d'exclusion stérique) pour la caractérisation des modifications structurales de protéines. Plus précisément, trois projets principaux ont été couverts dans le cadre de ce travail. Les premier projet (1) concerne l'étude des interactions faibles entre la protéine prion et le peptide Aβ par des approches de spectrométrie de masse native. Dans un second projet, la méthodologie est adaptée pour des interactions fortes peptide/peptide sur des peptides issus du birnavirus IBDV. Le troisième axe implique une collaboration étroite avec le groupe d'Human Rezaei à l'INRA de Jouy en Josas, reposant sur l'utilisation de méthodes biophysiques pour étudier les assemblages non-covalents de la protéine prion mé-rerpliée (PrPSC). Ces trois projets sont décrits plus précisément dans les trois paragraphes suivants . 1. Il a été montré préalablement que la protéine du prion dans son état cellulaire (PrP) et les assemblages de Aβ impliqués dans la maladie d'Alzheimer interagissaient entre eux. Cette interaction pourrait fournir à l'organisme une forme de contrôle sur l'accumulation de fibriles de Aβ impliqués dans la progression de la maladie d'Alzeihmer. L'objectif initial du projet de thèse était de mieux caractériser l'interaction entre le domaine intrinsèquement désordonné (IDP) de la PrP et le peptide Aβ, en se basant sur des approches combinant la spectrométrie de masse et la mobilité ionique incluant une mesure directe des complexes protéine – peptide et de leur section efficace de collision en phase gazeuse, la caractérisation structurale des complexes par des échanges H/D, à la fois top-down et bottom-up, et finalement en groupant les approches phase gazeuse et solution en profitant d'un couplage original entre la filtration en gel et la spectrométrie de masse à mobilité ionique. 2. Au-delà de ces interactions faibles, nous nous sommes aussi intéressés aux interactions fortes entre peptides qui ont été observées dans la formation de la capside du birnavirus IBDV. De travaux précédents ont montré une interaction en phase gazeuse particulièrement forte entre certains peptides de la capside. De ce fait, nous avons cherché à comprendre l'origine de ces interactions et les conditions de dépôt d'énergie durant une expérience de CID. Les résultats initiaux ont montré l'effet inattendu de la modification de certains paramètres expérimentaux sur l'énergie déposée dans les systèmes. Ces paramètres ont été étudiés pour obtenir une meilleure caractérisation des conditions de travail sur le Synapt G2Si HDMS utilisé pour ce travail, afin de permettre à tous de mieux appréhender l'importance de ces paramètres et leur influence potentielle sur les résultats d'expériences menées sur ce type de spectromètre de masse. 3. Le principe du mécanisme d'induction des changements conformationnels de la PrP et de la formation d'assemblages non-covalents et mé-repliés de PrP (PrPSc), responsable des maladies d'encéphalites spongiformes transmissibles, reste encore mal déterminé. La caractérisation biostructurale d'assemblages PrPSc a montré l'existence d'une hétérogénéité constitutive en termes de structure et de capacité de réplication au sein d'une souche de prion donnée. Cette hétérogénéité structurale est un point clef dans l'adaptation à l'hôte et l'évolution des souches PrPSc comme l'ont montré les expérience de transmission hétérotype. Le dernier projet de cette thèse s'intéresse à décrypter les mécanismes de cette diversification et la dynamique pouvant exister entre ces sous-types d'assemblages de PrPSc.

  • Titre traduit

    Characterisation of non-covalent PrPSC assemblies


  • Résumé

    The general topic of the thesis focuses on the use of biostructure methods (mass spectrometry, size-exclusion chromatography) for the characterization of protein structural modifications. More specifically, three main projects have been defined in the course of the work. The first project (1) covers the investigation of weak Prion/Abeta interactions by mass spectrometric approaches. In a second project the research is extended to strong peptide/peptide interactions based on peptides derived from the IBDV binavirus. The third project involves a close collaboration with the working group of Human Rezaei at the Institute National de la Recherche Agronomique in Jouy-en-Josas. Biophysical methods are used to study non-covalent misfolded prion protein (PrPSC) assemblies. The projects mentioned above are further characterized in the following paragraph. 1. It has been shown, that the cellular prion protein (PrP) and Abeta assemblies known from the Alzheimer disease can interact. This interaction could provide the organism with some control on the accumulation of Abeta fibrils involved in progression of Alzheimer's disease. The initial aim of this project was a better characterization of the interaction between the IDP domain of PrP and the Abeta peptide, focusing on techniques combining mass spectrometry and ion mobility including direct measurement of protein complexes and of their gas phase collision cross sections, structural characterization of the complexes through H/D exchange approaches, both bottom-up and top-down, and finally combining gas phase and solution phase approaches based on an original coupling between gel filtration chromatography and ion mobility mass spectrometry. Even so Abeta and the prion protein have been expressed, purified and intensively tested during the first year of this thesis the interaction between both biding partners proved too weak to be tested by the mentioned mass spectrometric approaches. 2. Beside weak protein interactions we are also interested in strong peptide interactions observed for peptides involved in the formation of the IBDV binavirus particle. Previous work has revealed remarkably strong gas-phase interactions between the peptides of this virus particle. Therefore, we want to better understand the basis of this interactions and the energy deposited on a system during CID experiments. Moreover, initial results have shown unexpected influence of changing device parameters on the energy deposited on a system. Theses parameters are assessed to obtain a better understanding of the working characteristics of the used Synapt HDMS and generate awareness for these critical paraments and their potential influence on experiments conducted on this type of mass spectrometer. 3. The principle mechanism of PrP conformational changes and the formation of non-covalent, misfolded PrP assemblies (PrPSc) responsible for the outbreak of TSE diseases still remains elusive. Biochemical characterization of PrPSC assemblies demonstrated the existence of a constitutional heterogeneity in terms of structure and specific replicative propensity within a given prion strain. This structural heterogeneity constitutes a key point in the host-adaptation and evolution of prion as revealed by heterotypic transmission experiments. Thus, one of the objectives of this thesis will be to decipher the mechanisms of this diversification and the dynamic between PrPSc subassemblies.