Exploration structurale et fonctionnelle de la partie C-terminale intrinsèquement désordonnée de ErbB2, une cible thérapeutique majeure des cancers du sein

par Louise Pinet

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Carine Van heijenoort.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Cnrs UPR 2301 - Institut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    Les récepteurs tyrosine kinase jouent un rôle essentiel dans la transduction de signaux extracellulaires en signaux intracellulaires, permettant à la cellule de s'adapter à son environnement. Il n'est pas surprenant que la surexpression de cette classe de protéines conduise à des dérèglements physiologiques majeurs, comme le développement de tumeurs malignes. C'est le cas de ErbB2, surexprimée dans environ 25% des cancers du sein. Cette surexpression entraîne l'activation constitutive des voies de signalisation associées à son activité tyrosine kinase pouvant induire plusieurs événements caractéristiques des cellules cancéreuses dont la prolifération, la résistance à l'apoptose et l'augmentation de la motilité cellulaire. Les études réalisées jusqu'à présent se sont concentrées sur les domaines extracellulaire et transmembranaire de ErbB2 et ont conduit à une thérapie efficace contre le cancer du sein. Cependant, la majorité des patients traités initialement de manière efficace deviennent résistants à ce traitement (trastuzumab) dans les trois ans qui suivent son début. L'objectif du projet, financé par l'ANR (janv 2014-juin 2017), est de décrire l'édifice supramoléculaire associé au domaine C-terminal intrinsèquement désordonné de ErbB2 (CtErbB2, 272aa), dont les phosphorylations conduisent à l'interaction avec plusieurs protéines adaptatrices et à l'activation de multiples processus cellulaires. Les défis de ce projet sont, d'une part, l'étude d'interactions multiples avec un domaine intrinsèquement désordonné de grande taille (272aa) riche en prolines conditionnées par plusieurs phosphorylations et, d'autre part, l'intégration des résultats structuraux de CtErbB2 dans un contexte plus global : (i) le contexte de ErbB2 entière par production en cellules eucaryotes (ii) le contexte cellulaire (partenariat avec Ali Badache, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille) (iii) le contexte thérapeutique (partenariat avec Françoise Guerlesquin, Institut de Microbiologie de la Méditerranée, Marseille). Actuellement, nous maîtrisons au laboratoire les conditions d'expression de CtErbB2 en grande quantité compatible avec une étude RMN et nous avons obtenu l'attribution des résonances du domaine non-phosphorylé. L'optimisation des conditions de phosphorylation du domaine est en bonne voie. L'étude de l'interaction de CtErbB2 avec Grb2 est bien avancée. Grb est une protéine modulaire constituée de trois domaine SH3-SH2-SH3 et joue un rôle crucial dans la transduction du signal associée à la voie MAPKinase impliquée dans la prolifération cellulaire. Le sujet de thèse portera sur l'analyse d'une part du rôle de Grb2 et de deux autres partenaires (MEMO et Shc), et, d'autre part, de l'organisation de la partie C-terminale au sein de la protéine entière : I - Comprendre les mécanismes de reconnaissance spécifiques de trois protéines adaptatrices et leur rôle dans l'activation des multiples processus cellulaires dans lesquels ErbB2 est impliquée. (i) Finalisation de l'étude de l'interaction CtErbB2/Grb2. (ii) Étude de l'interaction CtErbB2/domaine PTB (Phosphotyrosine Binding) de Shc. Ce domaine reconnaît a priori deux tyrosines phosphorylées de CtErbB2 (pY1201 et pY1227) et joue un rôle dans la promotion de la prolifération et de la désorganisation des cellules épithéliales. (iii) Étude de l'interaction CtErbB2/MEMO : Cette protéine interagit aussi avec pY1227 et est impliquée dans le contrôle de la migration cellulaire. II- Comprendre le processus de phosphorylation dans le contexte de la protéine entière. Nous chercherons à produire le récepteur complet en cellules eucaryotes (cellules d'insectes et cellules de mammifères). Les états de phosphorylation de la protéine ainsi obtenue seront analysés et corrélés à la modulation des interactions avec les protéines partenaires. Le caractère intrinsèquement désordonné de la partie C-terminale permettra d'effectuer l'étude des interactions directement sur la protéine entière solubilisée (domaine N-terminal extracellulaire - hélice transmembranaire - domaine kinase intracellulaire - domaine C-terminal). La phosphorylation de la partie C-terminale de ErbB2 est supposée être une trans-phosphorylation au sein d'hétérodimères impliquant ErbB2 et en particulier ErbB3. Nous utiliserons une stratégie de mutations ponctuelles pour pouvoir étudier les processus de phosphorylation "in vitro" au sein d'hétérodimères ErbB2-ErbB3 et d'homodimères d'ErbB2 potentiellement formés lors de la surexpression d'ErbB2 dans les cellules cancéreuses.

  • Titre traduit

    Structural and functional investigation of the C-terminal intrinsically disordered cytosolic fragment of ErbB2, a mejor therapeutic target against breast cancers


  • Résumé

    Receptor tyrosine kinases play a key role in transduction of extracellular cues onto intracellular signals, allowing the cell to adjust to its environment. It is not aberrant that overexpression of this class of proteins leads to dramatic physiological consequences as illustrated by malignant tumors. That is the case for ErbB2, which is overexpressed in about 25% of breast cancers. Its overexpression leads to constitutive activation of the signaling pathways associated to its tyrosine kinase activity, which can trigger several events that are caracteristic of cancer cells such as proliferation, resistance to apoptosis and increased cell motility. So far, experimantal studies focused on extracellular and transmembrane domains of ErbB2 and led to an effective therapy against breast cancer. However, most of the patients initially responding well acquire resistance to the treatment (trastuzumab) within three years. The aim of the project, funded by the ANR (Jan 2014 - June 2017), is to describe the supramolecular structure involving the intrinsically disordered C-terminal end of ErbB2 (CtErbB2, 268aa), the phosphorylation of which leads to the interaction with several adaptor proteins and the activation of multiple cellular processes. The challenges of this project are, on one hand, the study of multiple interactions with a large (268 aa), proline-rich, intrinsically disordered domain that are regulated by several phosphorylation events, and, on the other hand, the integration of structural results on CtErbB2 in a more general context: (i) the full-length ErbB2 context, by production in eukarotic cells (ii) cellular context (collaboration with Ali Badache, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille) (iii) therapeutic (collaboration with Françoise Guerlesquin, Institut de Microbiologie de la Méditerranée, Marseille). Currently in the laboratory we are able to express CtErbB2 in large amounts, compatible with NMR studies, and we obtained the assignment of the non-phosphorylated domain resonances. Optimization of the conditions for the domain phosphorylation is going well. Interaction studies between CtErbB2 and Grb2 is well advanced. Grb2 is a modular protein made up of three domains SH3-SH2-SH3, and plays a crucial role in signal transduction associated with the MAPKinase pathway involved in cell proliferation. The thesis project will focus on the analysis of both the role of Grb2 and two other partners (MEMO and Shc) and of the organisation os the C-terminal part within the full-length protein: I - Understanding the specific recognition mecanisms of three adaptor proteins et their role in the activation of multiple cellular processes involving ErbB2. (i) Completion of the study of the CtErbB2/Grb2 interaction (ii) Study of the CtErbB2/PTB (Phosphotyrosine Binding) domain of Shc. This domain recognize a priori two phoshorylated tyrosines of CtErbB2 (pY1201 and pY1227) and is involved in the promotion of proliferation and desorganization of épithelial cells. (iii) Study of the CtErbB2/MEMO interaction: This protein also interacts with pY1227 and is involved in cell migration regulation. II - Understanding the phosphorylation process within the full-length protein. We will try to produce the complete receptor in eukaryotic cells (insect cells and mammalian cells). The phosphorylation states of the produced that way will be analyzed and correlated to the modulation of the interaction with adaptor proteins. The intrinsic disorder of the C-terminal end will allow to perform interaction studies directly on the solubilized full-length protein (N-terminal extracellular domain - transmembrane helix - intracellular kinase domain - C-terminal domain). Phosphorylation of the C-terminal domain of ErbB2 is allegedly a trans-phosphorylation within heterodimers involving ErbB2 and, in particular, ErbB3. We will use ponctual mutation strategies to study phosphorylation processes "in vitro" within ErbB2-ErbB3 heterodimers and ErbB2 homodimers that are potentially assembled following ErbB2 overexpression in cancer cells.