Caractérisation de la variabilité intra-spécifique et cellulaire de Listeria monocytogenes à des températures basses

par Lena Fritsch

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Jean-Christophe Augustin.


  • Résumé

    Depuis plusieurs années, les cas de listériose d'origine alimentaire augmentent régulièrement en Europe. Les produits alimentaires prêts-à-consommer sont généralement incriminés car potentiellement contaminés par Listeria monocytogenes (Lm) et consommés sans cuisson préalable, d'où un risque accru pour les consommateurs. Les basses températures permettent de freiner la croissance de la majorité des bactéries pathogènes, et la maitrise de la chaîne du froid est donc très importante. Cependant, Lm est capable de croitre à basse température ce qui rend la maitrise du danger plus difficile. Les modèles d'appréciation quantitative des risques microbiens (AQRM) aident à caractériser le risque et à définir les mesures de maitrise pour préserver la santé publique. Avoir une meilleure compréhension du comportement de Lm proche de sa limite de croissance permettrait d'améliorer ces modèles. La validité d'un modèle pour prédire les conditions qui mènent à des niveaux critiques dans les aliments dépend fortement de sa capacité à décrire l'effet de l'environnement sur la latence et la probabilité de croissance. Les développements récents dans le séquençage du génome entier (WGS) ont ouvert de nouvelles opportunités pour expliquer la variabilité intraspécifique des phénotypes. L'application d'approches bioinformatiques combinées associant des génotypes WGS et des phénotypes spécifiques est une étape majeure dans le perfectionnement des modèles d'AQRM. Dans cette perspective, le premier objectif de cette thèse était l'exploration et l'application de différents outils pour mener des études d'association à l'échelle du génome (GWAS). Des approches différentes couvrant le pan-génome ont été appliquées à un ensemble de 51 souches de Lm pour identifier les caractéristiques génomiques expliquant leur capacité de croissance à basse température (2 °C). Plusieurs caractéristiques génomiques ont été identifiées comme étant associées à la croissance de Lm à basse température. Ces biomarqueurs pourront être utilisés dans des AQRM pour évaluer les risques liés aux sous-populations de Lm qui posent le plus grand risque dû à leur forte capacité à survivre et/ou à croître dans les aliments. Les résultats de la deuxième étude de cette thèse indiquent que la mise en œuvre des données de sous-typage WGS dans un modèle d'AQRM améliore l'estimation de la probabilité de listériose. Même si l'amélioration du modèle d'AQRM repose encore sur des hypothèses fortes (association du complexe clonal avec la virulence), ces travaux ont mis en évidence l'impact potentiel de la mise en œuvre des données génomiques dans l'AQRM. De grandes quantités de données génomiques sont nécessaires pour obtenir des marqueurs génétiques robustes. L'extraction et le séquençage de l'ADN génomique sont déjà entièrement automatisés et à haut débit. Toutefois ces souches doivent être caractérisées phénotypiquement, mais ces expériences sont couteuses en temps car faiblement automatisées. Par conséquent, la troisième étude de ce projet de thèse avait pour but de mettre au point une méthode de microscopie automatisée pour déterminer la probabilité de croissance et le temps de latence cellulaires. Des lames de milieu gélosé ont été inoculées avec des cellules de Lm et observées au fil du temps par microscopie à contraste de phase. Les enregistrements d'images de cellules individuelles et de micro-colonies ont été analysés à l'aide d'une procédure automatique d'analyse d'images. Cette méthode a été utilisée avec succès pour générer des distributions de temps de latence et les probabilités de croissance cellulaires de quatre souches de Lm. Cette méthode permet d'obtenir rapidement et facilement des données de comportement cellulaires dont l'acquisition prendraient des mois avec des méthodes indirectes. La caractérisation de la probabilité de croissance cellulaire et du temps de latence dans les modèles prévisionnels et donc lors d'évaluation de l'exposition augmente leur pertinence.

  • Titre traduit

    Characterization of the intra-specific variability of growth limits of Listeria monocytogenes at low temperatures and studies of mechanisms of adaptation to cold


  • Résumé

    During the last years, the cases of the foodborne disease listeriosis are steadily increasing in Europe. Listeriosis is mainly caused by the ingestion of food contaminated with the bacterium Listeria monocytogenes (Lm). Since low temperatures have the potential to inhibit the bacterial pathogens' growth, the cold chain is important to ensure the safety of the products. Contrary to other pathogens, Lm is hard to control by the cold chain because of its ability to grow at low temperatures even around freezing point. Quantitative microbial risk assessment (QMRA) models are used to better understand the risk for human health and therefore helps to find appropriate interventions for public health benefit. Improving risk assessment for Lm implies a better understanding of the pathogen behavior near growth limits and description of the effect of the environment on lag time (i.e. delay in growth when bacteria adapt to new environments) and growth probability. Moreover, the characterization of L. monocytogenes subtypes' phenotypic variability during cold exposure also helps to improve the precision of the predictions. Recent developments in whole genome sequencing (WGS) opened new opportunities for explaining the intraspecific variability of phenotypes. Successful association between WGS-data and specific phenotypes potentially contribute to better predicting microbial behaviors through the discovery of genomic markers. The successful application of combined bioinformatics approaches associating WGS-genotypes and specific phenotypes is a major step in the refinement of QMRA models. In this perspective, the first aim of this thesis was the exploration and application of different tools to conduct Genome Wide Association Studies (GWAS). Three different approaches, covering the pan-genome as also a phylogenomic-based method, were applied to a set of 51 L. monocytogenes strains to gain insights on the genomic features explaining their ability to grow at low temperatures (2 °C). Several genomic features (i.e. genes and SNPs), as well as specific phylogenetic sublineages, were identified as associated with L. monocytogenes' growth at low temperature. These biomarkers can be used in future QMRA studies to perform risk assessments targeted to the Lm subpopulations that pose the greatest risk linked to their higher ability to survive and/or grow in the food chain. Therefore, the 2nd study of this thesis focused on the refinements of a QMRA model for listeriosis from the consumption of cold-smoked salmon chain in France considering pheno-genotype associations (e.g. growth ability at low temperature and virulence). Even if QRMA model refinement is still using some strong hypotheses (i.e. Clonal Complex association with virulence), this work highlighted the potential impact of implementing genomic data in QMRA. Large genomic data sets are necessary to obtain robust genetic markers to use in QRMA. Genomic DNA extraction and sequencing are already fully-automated with high throughput. However, when performing pheno-genotype associations studies, experiments for phenotyping are often time-consuming and labor-intensive with a low degree of automation. Therefore, the aim of the third study of this thesis was to develop an automated microscopy method to determine the single-cell growth probability and lag time in cold conditions. Agar-based medium covering slides were inoculated with Lm cells and were observed over time by phase-contrast microscopy. Image recordings of the single-cells and micro-colonies were analyzed with an automatic image analysis procedure. This method was successfully used to generate single-cell lag time distributions and to estimate growth probability of the selected Lm strains. The characterization and the implementation of these variables into predictive models and thus exposure assessments have the potential to increase their certainty.