Caractérisation de la variabilité intra-spécifique des limites de croissance de Listeria monocytogenes à des températures basses et études des mécanismes d'adaptation au froid

par Lena Fritsch

Projet de thèse en Microbiologie

Sous la direction de Jean-Christophe Augustin.

Thèses en préparation à Paris Est , dans le cadre de École doctorale Agriculture, Alimentation, Biologie, Environnement, Santé (Paris ; 2015-....) , en partenariat avec LSA Laboratoire de Sécurité des Aliments - ANSES (laboratoire) depuis le 01-12-2016 .


  • Résumé

    Le présent projet de thèse s'inscrit dans un projet ANR Opticold. L'objectif global du projet de thèse est d'étudier les limites de croissance de la température minimale de cellules individuelles de différentes souches de Listeria monocytogenes et d'enquêter sur les mécanismes d'adaptation aux température de réfrigération. Le programme de doctorat est subdivisé en quatre tâches. 1. La première tâche est la caractérisation génomique des souches à croissance rapide ou faible. Ces souches seront séquencées (service externe) et une analyse bio-informatique sera menée afin d'évaluer l'association entre les SNP sur les gènes déjà connus impliqués dans l'adaptation au froid. Ensuite, les souches à croissance rapide et à faible seront comparées. Les séquences d'ADN provenant d'individus ayant le phénotype d'intérêt (cas) seront comparées à ceux sans (témoin) pour tester si des variantes sont significativement associées à un ou l'autre groupe. Basé sur le phénotype, le génotype de l'analyse, l'origine et les caractéristiques de virulence des souches, une sélection de la souche devant être inclus dans l'étude sera réalisée. 2. La deuxième tâche est le développement d'une méthode pour étudier les limites de la croissance à basse température. Afin d'améliorer le débit de la collecte des données au niveau cellulaire, deux méthodes seront étudiées. La première consistera à adapter les méthodes existantes «indirectes». L'utilisation de microplaques avec un nombre plus élevé de puits (par exemple 384, 1536), ainsi que l'automatisation de la détection de la croissance sera étudiée pour améliorer le débit des méthodes indirectes. La seconde consistera à l'utilisation de l'observation directe de la cellule avec une microscopie contraste de phase (équipé d'un 100 × un appareil photo de l'appareil à haute résolution objective). Ce dispositif sera utilisé pour étudier l'initiation de la croissance et phase de latence des cellules individuelles déposées sur des larmes microscopiques couvertes par milieu. Automatisation de l'acquisition d'image sur une grande surface sera utilisée pour atteindre un haut débit. 3. La troisème tache vise à caractériser les capacités d'adaptation au froid d'un grand nombre de souches. Avec la méthode la plus efficace de la tache 2 . L'Effort expérimental sera concentré sur yune gamme de température de 0-4 °C. Précisément un bain d'eau à température contrôlée sera utilisé pour l'expérience de longue date à basse température. Les distributions de capacité d'adaptation (la proportion des puits donnant une croissance par rapport à ceux qui ne donnent pas la croissance), le temps de croissance visible, et le taux de croissance, pour l'inoculum de cellules individuelles seront déterminées. Le nombre de souches qui sera étudié sera choisi en fonction des capacités d'analyse fournis par la méthode choisie. 4. Enfin, pour plusieurs souches le niveau d'expression des gènes déjà connus pour être impliqués dans la réponse à basse température d'expression seront caractérisés, soit au niveau de la cellule unique en utilisant transformée avec les plasmides portant le gène d'intérêt avec la GFP ou au niveau de la population avec le système PCR en temps réel. Le plan expérimental étudiera l'effet de la température pré-incubation (à savoir l'adaptation) sur les niveaux d'expression des gènes et la probabilité de croissance.

  • Titre traduit

    Characterization of the intra-specific variability of growth limits of Listeria monocytogenes at low temperatures and studies of mechanisms of adaptation to cold


  • Résumé

    The present PhD project is part of the The French National Research Agency (ANR) project Opticold. The global objective of the PhD project is to study the minimal temperature growth limits of individual cells of different strains of Listeria monocytogenes and to investigate the role of adaptation on the variability in the growth limits of individual cells. The PhD program is subdivided in four tasks. The first task is the genomic characterization of fast or low growing strains. These strains will be sequenced (external service) and bio-informatic analysis will be conducted in order to assess association between SNPs on already known genes involved in cold adaptation. Then the fast and low growing strain will be compared. DNA sequences from individuals with the phenotype of interest (cases) are compared with those without (controls) to test whether any variants are significantly associated with one or other group. Based on phenotype, genotype analysis, origin and virulence traits of the strains, a selection of strain to be included in the study will be carried out. The second task is the development of a method to study growth limits at low temperatures. In order to improve throughput of data collection at single cell level, two methods will be investigated. The first will consist in adaptation of the existing “indirect” methods. The use of microplates with higher number of wells (i.e. 384, 1536) as well as automation of detection of growth will be explored to improve throughput of indirect methods. The second will consist in the use of direct cell observation with a phase-contrast time-lapse microscopy (equipped with a 100× objective and a high-resolution device camera). This device will be used to study growth initiation and lag phase of individual cells deposited on microscopic slides covered by agar. Automation of image acquisition on large surface will be used to reach a high throughput. With the selected method in task two, the single cell growth probability will be characterized at low temperature. Experimental effort will be concentrated on 0-4°C range. Precisely temperature controlled water bath will be used for long time experiment at low temperature. Distributions of ability to adapt (proportion of wells giving growth versus those giving non growth), time to visible growth, and growth rate, for single cell inoculum will be determined. The number of strains that will be studied will be chosen according to the analytical capabilities provided by the selected method. For several strains along with the growth probability at low temperature, the expression level of already known genes involved in the response to low temperature will be characterized either at single cell level using transformed with plasmids carrying gene of interest with GFP or at population level with real-time PCR system. The experimental plan will explore the effect of pre-incubation temperature (i.e. adaptation) on growth probability and genes expression levels.