Identification et étude des régulateurs du processus de fission mitochondriale dans l'apoptose induite par Rbf1

par Juliette Bertheault De Noiron (De noiron)

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Isabelle Guenal et de Jessie Colin.

Thèses en préparation à l'Université Paris-Saclay (ComUE) , dans le cadre de École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....) , en partenariat avec Laboratoire de Génétique et Biologie Cellulaire (laboratoire) et de université de Versailles-Saint-Quentin-en-Yvelines (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    Situation du sujet rb est le premier gène suppresseur de tumeur à avoir été identifié dans des cellules humaines. Son inactivation fonctionnelle est une étape préalable au développement de nombreux cancers. Ses propriétés de suppresseur de tumeur ont longtemps été expliquées par son rôle bien connu de régulateur négatif du cycle cellulaire. Toutefois les données plus récentes de la littérature montrent clairement que Rb contrôle de nombreux autres processus cellulaires, bien que les mécanismes impliqués restent obscurs. Cela peut notamment s'expliquer par le fait que Rb lie plus de 200 partenaires dont des facteurs de liaison à l'ADN et des facteurs de remodelage de la chromatine, et régule ainsi un très grand nombre de gènes (pour revue voir [1]). La caractérisation de l'ensemble de ses activités constitue donc un enjeu majeur et permettra d'envisager de nouvelles stratégies pour traiter une proportion importante de cancers. La drosophile possède un homologue de Rb, Rbf1, dont les fonctions récapitulent parfaitement celles de la protéine Rb de mammifères. La drosophile, qui présente une moindre redondance des partenaires de Rb, est un modèle plus simple pour étudier les fonctions de Rb. C'est dans ce modèle, où nous pouvons à la fois utiliser des approches cellulaire, moléculaire et génétique que nous avons choisi d'étudier le rôle de Rb dans l'apoptose. De façon surprenante, l'implication de Rb dans l'apoptose est l'une de ses activités les moins bien comprises. Elle est assez complexe car différente selon les types cellulaires. Nos travaux chez la drosophile ont montré que l'activité pro- ou anti-apoptotique de Rbf1 dépend de l'état prolifératif ou post-mitotique des cellules qui l'expriment [2]. En effet, si Rbf1 est pro-apoptotique dans des cellules en prolifération, il présente des propriétés anti-apoptotiques dans des cellules différenciées. Ces dernières années, notre projet, qui bénéficie du soutien financier de la Ligue Contre le Cancer, s'est centré sur la recherche des facteurs impliqués dans l'apoptose induite par Rb. Ainsi, nous avons montré que l'activité pro-apoptotique de Rbf1 implique un complexe multiprotéique, le complexe dREAM, qui contient notamment Rbf1 et le facteur de transcription dE2F2. Rbf1, de manière dépendante du complexe dREAM, réprime d'une part la transcription du gène buffy (membre anti-apoptotique de la famille Bcl-2) et d'autre part active celle de how [3]. La protéine How (held out wings) régule indirectement l'apoptose en déstabilisant l'ARNm de l'inhibiteur de caspase dIAP1 ('drosophila Inhibitor of Apoptosis Protein 1') [3]. Enfin, nous avons montré que la répression du gène buffy, s'accompagne d'une activation de Debcl (protéine pro-apoptotique de la famille bcl 2). Debcl lie la protéine pro-fission Drp1 et induit une fission mitochondriale, une accumulation d'espèces activées de l'oxygène, une activation de la voie Jun kinase (JNK) [4] et in fine l'apoptose. • Rbf1 module la dynamique mitochondriale De façon originale nos travaux mettent en évidence un rôle de Rbf1 sur le contrôle de la dynamique mitochondriale. Des travaux récents chez les mammifères indiquent également que Rb aurait une activité au niveau de la mitochondrie [5,6]. De plus, Rb régule l'expression de gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale [7]. La compréhension de cette activité de Rb fait l'objet du projet de thèse proposé. La morphologie mitochondriale résulte d'un équilibre dynamique entre des évènements de fission et de fusion des membranes mitochondriales. Plusieurs protéines ont été identifiées comme contrôlant la fission (Drp1) ou la fusion (Mitofusine, OPA1) des mitochondries. Le contrôle de la dynamique mitochondriale est indispensable notamment pour assurer la production d'énergie et l'élimination des organites endommagés. La sévérité des phénotypes associés à une déficience des protéines régulant la dynamique mitochondriale en atteste. Une perte de fonction de fzo (fuzzy onions, GTPase impliquée dans la fusion mitochondriale) conduit à une stérilité chez les drosophiles mâles [8], un excès de clivage d'OPA1 est impliqué dans des cardiomyopathies humaines [9], l'inhibition de la fusion mitochondriale est également directement liée à plusieurs syndromes neurodégénératifs parmi lesquels la maladie de Charcot-Marie Tooth, la maladie de Parkinson ou encore l'atrophie optique dominante [10]. Toutefois les mécanismes et les régulateurs qui contrôlent les processus de fission et fusion des mitochondries ne sont que partiellement connus. Certains processus cellulaires impliquent des changements de la dynamique mitochondriale. En particulier, l'apoptose s'accompagne le plus souvent d'une augmentation de la fission des mitochondries. La protéine pro-fission mitochondriale Drp1 fait la navette entre le cytosol et la membrane mitochondriale externe. Elle y est notamment recrutée lors de l'apoptose et induit une constriction des membranes mitochondriales. Chez les mammifères, les mitochondries se fragmentent au niveau de points de fission où sont co-localisées la protéine pro-apoptotique de la famille Bcl-2 Bax et la protéine pro-fission Drp1 (revue : [11]). Les données que nous avons obtenues montrent qu'une interaction physique entre Debcl et Drp1 est nécessaire à l'apoptose induite par Rbf1 [4] et que Drp1 est recrutée au niveau des mitochondries de façon dépendante de Debcl. Ces événements provoquent une fragmentation du réseau mitochondrial et une accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui finalement activent la voie JNK et la mort cellulaire [4,12]. La surexpression de Buffy, qui lie Debcl, empêche la formation du complexe Debcl/Drp1 et l'apoptose induite par Rbf1. Toutefois, une mutation perte de fonction de buffy ne suffit pas à activer Debcl et à induire l'apoptose. Il existe donc un autre événement qui confère son activité pro-apoptotique à Debcl. Afin de comprendre les effets de Rbf1 sur la dynamique mitochondriale, nous rechercherons comment Rbf1 peut contrôler l'activation de Debcl, de Drp1, leur interaction et la production de ROS. Projet • Identification et étude des régulateurs du processus de fission mitochondriale dans l'apoptose induite par Rbf1 Pour cela nous chercherons à déterminer: - Comment est activée Drp1? - Quel est la place des autres acteurs de la dynamique mitochondriale? - Quel est le rôle de la régulation transcriptionnelle par Rbf1 dans le processus? Comment est activé Drp1? L'activation de Drp1 se traduit par une relocalisation de la protéine du cytoplasme vers les mitochondries, une interaction avec Debcl et une induction de la fission mitochondriale. Nous disposons déjà d'outils nous permettant de visualiser les mitochondries et des altérations de leur dynamique sur des tissus de drosophile. Nous mettrons au point de nouveaux outils nous permettant de visualiser simultanément par microscopie ou vidéomicroscopie les interactions Drp1/Debcl et les modifications du réseau mitochondrial (Plateforme Cymages). Des données bibliographiques montrent que, chez les mammifères, certaines modifications post-traductionnelles (phosphorylation, SUMOylation, ubiquitinylation) de Drp1 influencent sa localisation et certains facteurs susceptibles de réguler ce processus ont été identifiés [13], mais pas nécessairement au cours de l'apoptose. Les mécanismes qui régulent l'activation de Drp1 ne sont donc que partiellement compris, en particulier au cours des processus de mort cellulaire [14]. Des données préliminaires obtenues au laboratoire laissent penser que des modifications du statut de phosphorylation de Drp1 seraient impliquées dans notre système. Dans un premier temps, nous souhaitons caractériser les différentes modifications post-traductionnelles qui affectent Drp1 dans l'apoptose induite par Rbf1. Puis, nous rechercherons si ces modifications altèrent la localisation subcellulaire de Drp1, sa capacité à interagir avec Debcl et sa capacité à induire la fission mitochondriale. En parallèle, par une approche génétique de type gène candidat utilisant des mutants disponibles dans les stocks center, nous avons déjà identifié des régulateurs potentiellement responsables de certaines modifications de Drp1. Leur effet, sur la capacité de Drp1 à interagir avec le pro-apoptotique Debcl ou à induire la fission mitochondriale, doit à présent être évalué par des approches biochimiques et de microcopie. Par ailleurs, d'autres régulateurs potentiels doivent encore être testés dans notre modèle. Quel est la place des autres acteurs de la dynamique mitochondriale? Par une approche génétique, nous avons testé l'effet de plusieurs autres acteurs de la dynamique mitochondriale ou de la voie de neutralisation des ROS sur les phénotypes induit par Rbf1 (Pink, Parkin, Mfn, pumilio, Foxo, Sod2…). Certains d'entre eux modulent l'apoptose induite par Rbf1. Par des approches similaires à celles décrites précédemment, nous souhaitons étudier plus spécifiquement leurs effets sur les activités de Debcl et Drp1 afin de mieux caractériser les mécanismes d'activation de ces derniers. Quel est le rôle de la régulation transcriptionnelle par Rbf1 dans le processus? L'activité pro-apoptotique de Rbf1 est liée à sa capacité à contrôler l'expression de gènes cibles. Nous avons montré que l'expression des gènes buffy et how est régulée respectivement négativement et positivement par Rbf1 au sein d'un complexe dREAM [3]. Rbf1 et/ou des composants du complexe dREAM ont par ailleurs été détectés dans d'autres contextes par des approches haut débit (ChIP-on-chip ou ChIP-seq) sur le promoteur d'un certain nombre de régulateurs de la fission mitochondriale [15,16]. Par ailleurs, une analyse transcriptomique est prévue au laboratoire afin d'identifier les gènes dérégulés au cours de l'apoptose induite par Rbf1. Nous rechercherons parmi ces gènes quels sont ceux dont le niveau d'expression sensibilise à l'apoptose induite par Rbf1, et affecte l'activité du complexe Debcl/Drp1. Nous déterminerons, pour les candidats d'intérêt, s'il s'agit de cibles directes par immunoprécipitation de chromatine. L'ensemble de ces résultats permettra à la fois d'apporter des données nouvelles sur l'activité de Rbf1 et sur le contrôle de la dynamique mitochondriale durant l'apoptose. Dans la mesure où dans la plupart des modèles, l'apoptose est associée à une dérégulation de la dynamique mitochondriale, l'ensemble des régulateurs identifiés pourront potentiellement être impliqués dans d'autres processus d'apoptose et au-delà de l'apoptose dans les pathologies consécutives à une altération de la dynamique mitochondriale.

  • Titre traduit

    Identification and study of the regulators of mitochondrial fission during Rbf1-induced apoptosis


  • Résumé

    Rb is the first identified tumor suppressor gene. Its functional inactivation is a preliminary step in the development of many cancers. Its tumor suppressor properties have long been explained by its well-known role as a negative regulator of the cell cycle. However, recent data from the literature clearly show that Rb controls many other cellular processes, although the mechanisms involved remain unclear. This can be explained by the fact that Rb binds over 200 partners including DNA binding factors and chromatin remodeling factors, and thus regulates a large number of genes (for review see [1] ). Therefore, the characterization of its activities is a major issue that could provide new strategies for cancer therapies. Drosophila has a homologue of Rb, Rbf1 whose functions recapitulate those of mammalian Rb. We have chosen to study the role of Rb in apoptosis in Drosophila, which has less redundant Rb partners and is a simpler model for studying the functions of Rb using cellular, molecular and genetic approaches. Surprisingly, the involvement of Rb in apoptosis is one of its least understood activities. It is quite complex because it depends on cell types. Our work in Drosophila showed that pro- or anti-apoptotic activity of Rbf1 depends on the proliferative or post-mitotic status of the cells [2]. Indeed, if Rbf1 is pro-apoptotic in proliferating cells, it has anti-apoptotic properties in differentiated cells. In the recent years, our work focused on research of factors involved in Rb-induced apoptosis (project supported by the 'Ligue Contre le Cancer'). Thus, we have shown that the pro-apoptotic activity of Rbf1 involves a multiprotein complex, Dream, which contains Rbf1 and dE2F2 transcription factor. On one hand, Rbf1/Dream complex represses transcription of the buffy gene (anti-apoptotic member of the Bcl-2 family) and one another it actives the how gene [3]. How (Held out wings) indirectly regulates apoptosis by destabilizing mRNA caspase inhibitor dIAP1 ('Drosophila Inhibitor of Apoptosis Protein 1') [3]. Finally, we have shown that suppression of buffy, is associated with activation of Debcl (pro-apoptotic protein bcl-2 family). Debcl binds the fission DRP1 pro-protein and induces mitochondrial fission, an accumulation of reactive oxygen species, activation of Jun kinase pathway (JNK) [4] and ultimately apoptosis. • Rbf1 modulates mitochondrial dynamics Our work highlights the role of Rbf1 in the control of mitochondrial dynamics. Recent works in mammals also indicate that Rb have an activity at the mitochondrion [5,6]. In addition, Rb regulates the expression of genes involved in mitochondrial biogenesis [7]. Understanding the activity of Rb is the subject of the proposed thesis project. Mitochondrial morphology is the result of a dynamic balance between the fission and fusion events of mitochondrial membranes. Several proteins have been identified as controlling the fission (DRP1) or fusion (mitofusin, OPA1) mitochondria. The control of mitochondrial dynamics is necessary in particular to ensure energy production and disposal of damaged organelles. This is attested by the severity of the phenotypes associated with a deficiency of proteins that regulate mitochondrial dynamics. Loss of function of FZO (fuzzy onions, GTPase involved in mitochondrial fusion) leads to sterility in male Drosophila [8], excessive cleavage OPA1 is involved in human cardiomyopathy [9], and inhibition of mitochondrial fusion is also directly linked to several neurodegenerative syndromes including disease Charcot-Marie Tooth disease, Parkinson's disease or dominant optic atrophy [10]. However the mechanisms and regulators that control mitochondrial fission and fusion processes are only partially known. Some cellular processes involve changes in mitochondrial dynamics. In particular, apoptosis is most often accompanied by an increase in mitochondrial fission. The DRP1 fission protein shuttles between the cytosol and the outer mitochondrial membrane. It is especially recruited during apoptosis and induces constriction of mitochondrial membranes. In mammals, mitochondria are fragmented at points where fission is co-located the pro-apoptotic protein of the Bcl-2 family, Bax, and pro-fission protein DRP1 (review: [11]). The data we obtained show that physical interaction between Debcl and DRP1 is necessary for apoptosis induced by Rbf1 [4] and that DRP1 is recruited at the mitochondria-dependent manner Debcl. These events lead to fragmentation of the mitochondrial network and accumulation of reactive oxygen species (ROS) which finally activate the JNK pathway and cell death [4,12]. Overexpression of Buffy, which binds Debcl prevents the formation of the Debcl / DRP1complex and induced apoptosis Rbf1. However, a buffy loss of function mutation is not enough to activate Debcl and induce apoptosis. Thus, there must be another event that drive the pro-apoptotic activity in Debcl. To understand the effects of Rbf1 on mitochondrial dynamics, we will look how Rbf1 can control the activation of Debcl and DRP1, their interaction and the production of ROS. Project • Identification and study of the regulators of mitochondrial fission during Rbf1-induced apoptosis For this purpose, the project aims at determining: - How is DRP1 activated? - What is the role of other factors involved in mitochondrial dynamics? - What is the role of Rbf1-mediated transcriptional regulation by in the process? How is DRP1 activated? DRP1 activation results in a relocation of the protein from the cytosol to mitochondria, its interaction with Debcl and induction of mitochondrial fission. We already have tools allowing us to visualize mitochondria and alterations in dynamics of Drosophila tissues. We will develop new tools allow us to simultaneously detec DRP1 by video microscopy, DRP1 / Debcl interactions and changes in the mitochondrial network (Platform Cymages). Bibliographic data show that, in mammals, post-translational modifications (phosphorylation, SUMOylation, ubiquitination) of DRP1 influence its location and some factors that regulate this process have been identified [13], but not necessarily during apoptosis. The mechanisms that regulate the activation of DRP1 therefore are only partially understood, particularly during cell death processes [14]. Preliminary data obtained in the laboratory suggest that DRP1 phosphorylation status changes are involved in our system. First, we wish to characterize the different post-translational modifications that affect DRP1 during Rbf1-nduced apoptosis. Then, we will look whether these changes alter the subcellular localization of DRP1, its ability to interact with Debcl and its ability to induce mitochondrial fission. In parallel, using a genetic approach with candidate genes using mutants available from stock centers, we have already identified regulators potentially responsible of some DRP1 modifications. Their effect on the capacity of DRP1 to interact with Debcl and to induce mitochondrial fission, must now be evaluated by biochemical and microscopy approaches. Furthermore, other potential regulators must still be tested in our model. What is the role of other factors involved in mitochondrial dynamics? Using a genetic approach, we tested the effect of several other factors involved in mitochondrial dynamics or in ROS elimination on the phenotypes induced by Rbf1 (Pink, Parkin, Mfn, pumilio, Foxo, Sod2 ...). Some of them modulate Rbf1-induced apoptosis. By similar approaches to those described above, we wish to study more specifically the effects on the activities of Debcl and DRP1, and to better characterize their mechanisms of activation. What is the role of transcriptional regulation by Rbf1 in the process? The pro-apoptotic activity of Rbf1 is related to its ability to control the expression of target genes. We showed that the expression of buffy and how is downregulated and upregulated by Rbf1 respectively, within a Dream complex [3]. Rbf1 and/or Dream complex components have also been detected in other contexts by high-throughput approaches (ChIP-on-chip or ChIP-seq) on the promoter of a number of regulators of mitochondrial fission [ 15,16]. Moreover, a transcriptomic analysis will be done in the laboratory to identify genes dysregulated during Rbf1-induced apoptosis. We will look among these genes which are those whose level of expression sensitizes to Rbf1-induced apoptosis, and affects the activity of Debcl/DRP1 complex. We will determine, for candidates of interest, if they are direct targets of Rbf1 by chromatin immunoprecipitation. All together, these results will both provide new data on the activity of Rbf1 and on the control of mitochondrial dynamics during apoptosis. Insofar as in most models apoptosis is associated with a deregulation of the mitochondrial dynamics, identified regulators could potentially be involved in other cell death processes and, beyond apoptosis, in pathologies consecutive to impaired mitochondrial dynamics.