Développement d'une méthode non invasive multitraceurs pour évaluer in vivo la biodisponibilité des acides aminés des protéines de protéo-oléagineux

par Romain Tessier

Projet de thèse en Sciences de la nutrition

Sous la direction de Claire Gaudichon.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Agriculture, Alimentation, Biologie, Environnement et Santé , en partenariat avec PNCA - Physiologie de la Nutrition et du Comportement Alimentaire (laboratoire) et de AgroParisTech (France) (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-12-2016 .


  • Résumé

    Les oléagineux, notamment le colza et le tournesol, représentent en France et en Europe un « gisement » important de protéines qui pourraient être valorisées en alimentation humaine si leur qualité nutritionnelle est satisfaisante. Dans ce contexte, la biodisponibilité des acides aminés de ces protéines est un paramètre important mais dont la détermination est méthodologiquement difficile. Le projet de thèse a pour objectif de développer une méthode multritraceurs peu invasive pour évaluer la biodisponibilité des acides aminés. Cette méthode sera validée par comparaison avec la méthode de référence actuelle permettant d'évaluer le DIAAS (Digestible Indispensable Amino Acid Score). L'étude portera sur des protéines végétales issues de différents protéo-oléagineux parmi le colza, le tournesol, le lin et le lupin. Les marquages isotopiques seront réalisés par Terres Inovia, dans le cadre d'un projet collaboratif ayant obtenu un financement, entre autres, de l'ANR (Prodige). L'étude comprendra une étude pilote chez le rat et une étude clinique chez le patient iléostomisé. L'étude pilote chez le rat sera réalisée avec les protéines de tournesol. Les animaux ingèreront un repas test comprenant les protéines de tournesol marquées au 15N et 2H ainsi qu'une dose traceur de protéines de spiruline enrichie en 13C et un traceur non absorbable (oxyde de chrome). Du sang sera prélevé à la queue toutes les 2 heures jusqu'au sacrifice des animaux, 6 heures après ingestion du repas. Les contenus intestinaux seront récupérés dans chaque segment intestinal. Dans les contenus intestinaux, la digestibilité des protéines de tournesol ainsi que celle des acides aminés indispensables seront évaluées par mesure des enrichissements en isotopes stables. Dans le même temps nous analyserons les enrichissements isotopiques de chaque acide aminé indispensable dans l'aliment avant ingestion et dans le sang. Cela permettra d'obtenir un score de ratio isotopique pour chaque acide aminé, défini par la relation 15N/13C repas/15N/13C sang. Ces scores seront comparés aux digestibilités obtenues par la méthode directe (contenus intestinaux) L'étude clinique sera réalisée au Centre de Recherche en Nutrition Humaine à Bobigny. Un groupe de 10 volontaires iléostomisés sera recruté. Les sujets auront entre 18 et 65 et un IMC compris entre 18 et 30. Seront exclus les patients atteints de maladies digestives évolutives. Ces sujets ingèreront, avec 200mL d'eau, un biscuit comprenant 20 grammes de protéines d'oléagineux marquées et une dose de 200 milligrammes de spiruline 13C. Les volontaires testeront dans un ordre randomisé 3 protéines différentes en trois occasions non consécutives. Avant ingestion, les urines et du sang seront prélevés. Du sang sera prélevé toutes les 30 minutes pendant 3 heures après ingestion et de l'urine toutes les 2h pendant 8h. Les digesta seront regroupés par périodes de 4 heures. Les enrichissements isotopiques des acides aminés indispensables seront mesurés dans le sang et l'aliment afin de déterminer la digestibilité protéique. Ces résultats seront comparés à ceux obtenus par la méthode directe. Les analyses se feront par spectrométrie de masse à ratio isotopique (IRMS) couplés à différents fours et colonnes de chromatographie : - Digestibilité totale des protéines : déterminée par la mesure des enrichissements en 15N et 13C dans les digesta par EA-IRMS - Digestibilité individuelle des acides aminés : déterminée après hydrolyse des protéines en mesurant les enrichissements des acides aminés en 15N et 13C par GC-C-IRMS, ainsi que les teneurs en acides aminés dans les digesta. - Utilisation post prandiale des protéines : déterminée à partir des enrichissements 15N dans l'urée urinaire et plasmatique, des protéines et des acides aminés par EA-IRMS, après purification de ces fractions sur une résine échangeuse de cations. L'excrétion de 13CO2 sera mesurée dans l'air expiré par Multiflow-IRMS. - Biodisponibilité relative d'acides aminés : évaluée par la mesure de l'enrichissement en 13C, 2H et 15N des acides aminés libres et liés aux protéines dans le plasma, en utilisant GC-C-IRMS. Le rapport 15N / 13C ou 2H / 13C seront comparés à la même proportion dans le repas d'essai.

  • Titre traduit

    Development of multitracer methods to asses in vivo the bioavailability of amino acids from oilseed proteins


  • Résumé

    Oilseeds, particularly rapeseed and sunflower, represent an important resource of proteins in France and Europa. These proteins can be used for human nutrition, but their nutritional quality must be challenged. The bioavailability of amino acids is a reliable criteria but is difficult to determine. This project aims to develop a low-invasive method to assess the bioavailability of amino acids from dietary proteins. This method will be validated by comparison to the current reference method allowing an assessment of the DIAAS (Digestible Indispensable Amino Acid Score). Proteins from different oilseeds, like rapeseed, sunflower, flaxseed or lupin, will be studied. Proteins will be labeled with stable isotopes by Terres Inovia. This project belongs to a collaborative project that was partly funded by the ANR (Prodige). A pilot study in rats and a clinical study in ileostomized patients will be implemented. In the pilot study, rats will ingest a test meal including sunflower proteins that are labeled with 15N and 2H, a tracer dose of 13C -labeled spirulina and a non-absorbable marker (chromium oxide). Blood will be collected from tail vein every 2 hours until sacrifice, 6 hours after ingestion of food. Gastro-intestinal contents will be collected in every intestinal segment. In intestinal contents, stables isotopes enrichments will allow to assess protein and amino acids digestibility from sunflower. Additionally, isotopic enrichment of each indispensable amino acid will be measured in the meal and in blood. We will obtain isotopic ratios for every amino acid, 15N/13C meal/15N/13C blood. These scores will be compared to digestibility obtained using the direct method (intestinal contents). For the clinical study, a groupe of ileostomized volunteers (n=10) will be recruited in the Clinical Research Center in Human Nutrition, Bobigny. The volunteers must be aged 18 to 65 years old and have a BMI between 18 and 30. Patients suffering from a progressive disease are to be excluded. These subjects will ingest, along with 200 mL of water, a biscuit providing 20 g of labeled proteins and 200 mg of 13C-spirulina. Volunteers will test in a randomized order three different proteins at different non-consecutive days. Before ingestion, urines and blood will be sampled. Blood will be collected every 30 min for 3 hours and urines will be collected every 2 hours for 8 hours. Digesta will be pooled by 4 hours periods. Isotopic enrichments of indispensable amino acids will be measured in blood and in the meal so as to determine amino acid bioavailability. These results will be compared to those obtained by the direct method. Isotope-ratio mass spectrometry coupled to different systems will be used to analyze samples: - Total protein digestibility will be determined by measurement of 15N and 13C enrichments in the digesta by EA-IRMS, as described in the rat study.
 - Individual amino acid digestibility will be determined after protein hydrolysis by measuring 15N and 13C enrichments in amino acids by GC-C-IRMS, as well as amino acid contents in the digesta. - Postprandial protein utilization will be determined from the 15N enrichments in urinary urea and plasma urea, protein and amino acids by EA-IRMS, after purification of these fractions on cation exchange resin. Excretion of 13CO2 will be measured in expired air by multiflow-IRMS. - Relative amino acid bioavailability will be assessed by measuring the 13C, 2H and 15N enrichments in free and protein bound amino acids in the plasma, using GC-C-IRMS. The ratio 15N/13C or 2H/13C will be compared to the same ratio in the test meal.