Comment la localisation membranaire d'un récepteur ou d'un canal ionique détermine sa fonction ? Une approche de nanotechnologie appliquée aux cellules cardiaques

par Marion Barthe

Projet de thèse en Physiologie, physiopathologie

Sous la direction de Rodolphe Fischmeister et de Nicolas Tsapis.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Signalisation et physiopathologie cardiaque (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    L'activation chronique de la cascade de signalisation récepteur β-adrénergique (β-AR)/AMPc joue un rôle central dans l'insuffisance cardiaque (IC) et la mort subite, comme l'ont démontré les effets bénéfiques d'un traitement aux β-bloquants. La stimulation β-AR agit par l'intermédiaire de l'activation de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA), qui phosphoryle plusieurs protéines clé, dont le canal Ca2+ de type L (LTCC). Les LTTCs sont responsables de l'entrée de Ca2+ dans la cellule myocardique, qui déclenche la libération de Ca2+ intracellulaire par le réticulum sarcoplasmique (RS) par l'intermédiaire des récepteurs de la ryanodine. En condition aiguë, l'activation β-AR des canaux LTCC conduit à une augmentation de la force de contraction. Cependant, l'activation chronique des β-ARs, comme cela se produit dans l'IC, conduit également à une entrée et un relargage de Ca2+ excessifs : cela provoque une surcharge de Ca2+ intracellulaire, la dépolarisation du potentiel de membrane des cellules, le déclenchement de potentiels d'action spontanés, ce qui conduit à des arythmies ventriculaires et à la mort subite. Par conséquent, il est impératif de mieux comprendre comment les β-ARs régulent l'activité des LTCCs dans les cellules myocardiques, et en particulier de mieux connaitre la localisation de ces deux familles de protéines dans la membrane cellulaire. Un cardiomyocyte ventriculaire est une cellule fortement différenciée. Sa membrane cellulaire est composée de deux compartiments: une membrane de surface et un réseau dense de tubules transverses, ou tubules T. Les tubules T sont des invaginations de la membrane de surface qui forment un réseau de tubes plongeant vers le centre de la cellule. Ils sont essentiellement alignés le long des disques Z des sarcomères, permettant le développement de jonctions dyadiques avec le RS qui sont cruciales pour le déclenchement des transitoires Ca2+ nécessaires à la contraction des cardiomyocytes. Les LTCCs et β-ARs, ainsi que beaucoup d'autres protéines membranaires, sont situés dans les deux compartiments, mais à des densités différentes. L'objectif général de ce projet est d'explorer la fonction des LTCCs et β-ARs selon qu'ils sont localisés dans la membrane de surface ou dans les tubules T. Pour cela, nous allons développer une approche innovante de nanotechnologie en combinant l'expertise d'un laboratoire INSERM spécialisé dans la signalisation cellulaire cardiaque (R. Fischmeister, UMR-S 1180) et d'un laboratoire CNRS spécialisé en sciences pharmaceutiques et galénique (Nicolas Tsapis, UMR8612 Institut Galien Paris-Sud). La stratégie utilisée est basée sur la préparation de nanoparticules (NPs) fonctionnalisées décorées avec des agonistes ou antagonistes des LTCCs ou des β-ARs, liés de manière covalente à leur surface. Les NPs auront un diamètre de 100-150 nm pour leur empêcher d'accéder dans les T-tubules. Alors que des agonistes libres seront utilisés pour activer les LTCCs ou β-ARs situés sur l'ensemble de la membrane cellulaire, des agonistes immobilisés sur la surface des NPs seront utilisés pour n'activer que les LTCCs ou β-ARs situés dans la membrane externe. L'application d'un agoniste libre des LTCCs ou β-ARs en présence d'une concentration saturante d'antagoniste immobilisé sur NP sera utilisé pour permettre l'activation des LTCCs ou β-ARs situés dans la membrane des T-tubules. Cette stratégie sera appliquée sur des cardiomyocytes ventriculaires de rats adultes isolés à partir d'animaux sains ou IC afin d'explorer les altérations spécifiques des deux sous-populations de LTCCs et β-ARs lors du remodelage pathologique. Comme les LTCCs et β-ARs sont des cibles thérapeutiques pertinentes, une meilleure compréhension du rôle des sous-populations respectives de ces deux familles de protéines dans les conditions physiologiques et pathologiques peut conduire à de nouveaux systèmes d'adressage de médicaments ciblant la sous-population concernée. Ce projet est financé par l'ANR (ANR-15-CE14-0014-01, 2015-2019).

  • Titre traduit

    How does the spatial location of a membrane receptor/channel affect its function: A nanotechnology approach in cardiac cells


  • Résumé

    Chronic activation of β-adrenergic receptor (β-AR)/cAMP cascade is centrally involved in heart failure (HF) and sudden death, as demonstrated by the beneficial effect of β-blocker therapy. β-AR stimulation acts via activation of the cAMP-dependent protein kinase (PKA) which phosphorylates a number of key proteins, and most importantly the L-type Ca2+ channel (LTCC). LTTCs are responsible for Ca2+ entry into the myocardial cell, which triggers intracellular Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum (SR) via ryanodine receptor. Under acute condition, β-AR activation of LTCCs leads to an increase in the force of contraction. However, chronic β-AR activation as occurs in HF also leads to excessive Ca2+ entry and release: this causes intracellular Ca2+ overload, cell depolarisation, spontaneous action potentials, which eventually lead to ventricular arrhythmias and sudden death. Therefore, it is imperative to better understand how β-ARs regulate LTCCs in ventricular cells, and in particular how they are compartmentalized within the cardiac cell membrane. One potential source of compartmentation in the highly structured ventricular cardiomyocyte is the physical arrangement of the sarcolemma. The most evident features are the transverse tubules (T-tubules), a network of deep invaginations of the surface membrane which form an interconnected network of tubes penetrating deep into the interior of the cardiomyocyte. T‐tubules mainly run along the z‐disks of sarcomeres, allowing the development of dyadic junctions with the SR that are crucial in Ca2+ transients regulating cardiomyocyte contraction. LTCCs and β-ARs, as well as other membranes proteins, are located in both compartments but at different densities. The general goal of this project is to explore how location of LTCCs and β-ARs in either surface or T‐tubule membrane impacts on their function. We will use an innovative nanotechnology approach by combining the expertise of an INSERM laboratory specialized in cardiac cellular signaling (R. Fischmeister, UMR-S 1180) and a CNRS laboratory specialized in pharmaceutical sciences and drug delivery (Nicolas Tsapis, UMR8612 Institut Galien Paris-Sud). Both belong to the University Paris-Sud and the LabEx LERMIT and are located on the campus of the Faculty of Pharmacy in Châtenay-Malabry. The strategy is based on the preparation of functionalized nanoparticles decorated with LTCC or β-AR agonists or antagonists covalently bound to their surface. The nanoparticles will have a diameter of 100-150 nm to prevent them accessing T‐tubule membranes due to steric hindrance. While free agonists will be used to activate both external and T‐tubule LTCCs and β-ARs, respectively, agonists immobilized on the surface of nanoparticles will be used to only activate those located in the external membrane. A free agonist applied in the presence of a saturating concentration of nanoparticle-immobilized antagonist will be used to only activate LTCCs or β-ARs located in the T‐tubule membrane. This strategy will be applied in adult rat ventricular myocytes isolated from either normal or HF animals to explore the specific alterations of the two subpopulations of LTCCs and β-ARs during pathological remodeling. Since LTCCs and β-ARs are relevant targets for therapeutic drugs, a better understanding of the role of the respective sub-populations of these major membrane proteins in physiological and pathological settings may lead to new drug delivery systems that would allow a specific targeting of the relevant sub-population. This project is funded by ANR (ANR-15-CE14-0014-01, 2015-2019).