Etude des undécaprényl-pyrophosphate phosphatases dans la biogenèse de l'enveloppe et la physiologie bactérienne

par Xudong Tian

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Thierry Touzé.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    L'enveloppe des bactéries est composée de nombreux polysaccharides, dont certains comme le peptidoglycane et les lipopolysaccharides (LPS) sont essentiels à leur survie. Ces macromolécules sont impliquées dans les relations qu'entretiennent les bactéries avec leur environnement, en modulant l'adhésion, la mobilité, la formation de biofilm, la communication intercellulaire, la résistance aux antibiotiques et la reconnaissance par le système immunitaire de l'hôte, autant de paramètres qui affectent le fitness et la virulence des bactéries. En outre, les bactéries réalisent des modifications structurales de ces polysaccharides de surface pour s'adapter à différentes conditions. La biosynthèse de ces polymères nécessite la translocation de sous-unités sucre au travers de la membrane plasmique. Cette étape requiert un lipide membranaire particulier, l'undécaprényl-phosphate (C55-P) utilisé comme porteur lipidique. Les sous-unités sont greffées sur le lipide du côté cytoplasmique de la membrane, générant des intermédiaires membranaires de structure C55-PP-sucre. Ces intermédiaires sont alors transloqués à l'aide d'une flippase et les sous-unités sont finalement transférées sur un polymère accepteur du côté périplasmique. Cette ultime réaction libère le lipide porteur sous une forme undécaprényl-pyrophosphate (C55-PP) inactive qui va être recyclé. Le C55-P est généré par la déphosphorylation de son précurseur, le C55-PP, qui est lui-même formé par synthèse de novo ou bien par recyclage. Notre équipe a identifié deux familles de protéines membranaires possédant une activité C55-PP phosphatase : la famille BacA et la famille PAP2 (type 2 phosphatidic phosphatase). Escherichia coli possède une protéine BacA et 3 membres de la famille PAP2 (PgpB, YbjG et LpxT) qui participent à la biosynthèse du C55-P et l'inactivation de plusieurs gènes est alors nécessaire pour obtenir un phénotype létal. Afin de mieux comprendre la multiplicité d'enzymes pour une même activité, notre équipe a entrepris une étude détaillée de leurs relations structures-fonctions. Le laboratoire a alors mis en évidence une propriété inattendue de l'enzyme LpxT qui catalyse le transfert d'un groupement phosphate du C55-PP sur une molécule de lipide A, la partie endotoxine des LPS, générant du C55-P et une forme modifiée (c.-à-d. phosphorylée) de LPS, dont le rôle dans le fitness et/ou les relations bactérie-hôte n'est pas encore établi. Ces données ont révélé un nouveau rôle pour le C55-PP comme donneur de phosphate dans le périplasme et cela suggère que les autres C55-PP phosphatases puissent exercer des activités similaires sur des molécules périplasmiques cibles spécifiques. De telles réactions de phosphotransfert pourraient être importantes pour contrôler l'homéostasie de l'enveloppe bactérienne en réponse à différentes conditions. Ainsi, ces enzymes ne sont pas seulement requises pour la synthèse du principal talon d'Achilles des bactéries, c.-à-d. leur paroi, via la formation de lipide porteur, mais elles participent également au remodelage des composants de l'enveloppe. Ce projet de thèse vise à mieux comprendre le rôle physiologique de ces multiples phosphatases chez E. coli par une combinaison d'approches pluridisciplinaires et complémentaires (génétique, biochimie, biologie structurale, physiologie bactérienne et immunologie). Nous étudierons les relations entre métabolisme du C55-P et la physiologie bactérienne (fitness, sensibilité aux antimicrobiens, mobilité, formation de biofilm, reconnaissance par l'hôte, colonisation et virulence) par une expression différentielle des C55-PP phosphatases (c.-à-d. à l'aide de souches mutantes). Les relations hôte-microorganisme seront explorées en collaboration avec l'équipe d'Ivo Boneca-Gomperts de l'Institut Pasteur spécialiste de ces questions. De façon complémentaire, les structures et les teneurs de peptidoglycane et des LPS (deux stimulateurs majeurs du système immunitaire de l'hôte) seront déterminées. Dans la mesure où le C55-P et son précurseur possèdent de multiples fonctions (la biosynthèse de plusieurs polymères et des réactions de phosphorylation), ils constituent un carrefour métabolique, dont la régulation devrait être intimement liée au contrôle de l'homéostasie de l'enveloppe. En conséquence, nous explorerons aussi les mécanismes de régulation des C55-PP phosphatases. LpxT a récemment été décrite pour être inhibée par un petit peptide membranaire nommé PmrR via un mécanisme inconnu (Kato et al., 2012). L'inhibition de LpxT permet à d'autres enzymes de modifier les LPS différemment, de sorte à conférer une résistance à des peptides cationiques antibactériens (CAMPS) et d'échapper à la reconnaissance par le système immunitaire de l'hôte. Nous étudierons ce mécanisme de régulation de LpxT au niveau cellulaire, en identifiant les facteurs environnementaux et génétiques qui régulent l'expression de PmrR, et aussi au niveau moléculaire, afin de mieux comprendre le mode d'action de ce peptide membranaire. Nous avons d'ores et déjà mise en évidence la formation d'un complexe stable LpxT/PmrR. Cette interaction sera étudiée de façon détaillée par une combinaison d'approches in vitro et in vitro (microcalorimétrie, pull-down, mutagénèse dirigé ou aléatoire, cristallographie, et double hybride bactérien). L'analyse structurale sera réalisée en collaboration avec un groupe de cristallographes à l'université de Liège (http://www.cip.ulg.ac.be) avec laquelle notre équipe a déjà obtenue les structures d'une phosphatase de type PAP2 et de BacA à haute résolution. Afin d'explorer davantage le rôle des C55-PP phosphatases dans la modification d'autres composants de l'enveloppe (protéines, lipides ou carbohydrates), pour examiner leur contribution dans la synthèse de certains polymères en particuliers ou pour mettre en évidence de nouveaux mécanismes de régulation, nous étudierons le réseau d'interaction auquel ces protéines participent. En effet, la plupart des protéines fonctionnent en complexes multi-protéiques pour conduire des processus cellulaires précis et l'identification de nouveaux partenaires d'une protéine d'intérêt fournie des informations précieuses sur les mécanismes auxquels cette protéine d'intérêt participe. Pour ce faire, deux approches complémentaires seront utilisées : le système du double hybride bactérien (BACTH) et l'analyse par spectrométrie de masse de complexes isolés. Le système BACTH permet d'identifier de nouveaux partenaires par un criblage d'interactants entre une protéine d'intérêt, c.-à-d. une C55-PP phosphatase comme appât et une banque d'ADN génomique comme proie. L'analyse par spectrométrie de masse de protéines purifiées par affinité est réalisée en exprimant des versions tagguées His6 des phosphatases. La phosphatase et ses interactants sont enrichis en une seule étape d'immun-précipitation à l'aide d'un anticorps anti-His6 et les partenaires sont identifiés par spectrométrie de masse. Les interactions identifiées par ces deux approches seront ensuite confirmés par des méthodes biochimiques complémentaires (pull-down, microcalorimétrie) et la signification de ces phénomènes sera davantage explorée.

  • Titre traduit

    Role of membrane undecaprenyl-pyrophosphate phosphatases in bacterial cell envelope biogenesis and cell physiology


  • Résumé

    The bacterial cell envelope is composed of many polysaccharides such as the peptidoglycan and the lipopolysaccharides (LPS) that are required for survival. These polysaccharides are involved in the interactions that bacteria establish with their surroundings, including adhesion, mobility, biofilm formation, cell-cell communication, antibacterial resistance and host immune system recognition; many parameters that affect bacterial fitness and virulence. Besides, bacteria operate fine structural modifications of these polysaccharides to adapt to various environments. The biosynthesis of these cell-surface polymers implies the translocation of the sugar sub-units across the plasma membrane; a step that requires the undecaprenyl phosphate lipid (C55-P) used as a lipid carrier (Manat et al., 2014). The sub-unit is transferred to this lipid at the cytoplasmic face of the membrane, yielding a series of lipid intermediates of C55-PP-sugar(s) structure. The intermediate is subsequently translocated across the membrane with the aid of a flippase and the glycan moiety is finally transferred to the nascent acceptor polymer at the periplasmic side of the membrane. This reaction releases the lipid carrier in an inactive undecaprenyl pyrophosphate form (C55-PP), which is recycled. C55-P is generated by the dephosphorylation of C55-PP precursor, itself arising from either de novo synthesis or recycling following the transfer of the glycan sub-unit to the final acceptor. Our laboratory has identified two families of membrane proteins exhibiting C55-PP phosphatase activity: BacA protein and members of the PAP2 (type 2 phosphatidic acid phosphatase) super-family (El Ghachi et al., 2004, 2005). Escherichia coli possesses one BacA and 3 PAP2 enzymes (PgpB, YbjG and LpxT) involved in C55-P synthesis and multiple gene inactivations are required to elicit a lethal phenotype. In order to highlight the significance of such a multiplicity of enzyme for a single function, we initiated a detailed structural and functional characterization of these membrane proteins (Touzé et al., 2008a, 2008b, Hynninen et al., 2009; Manat et al., 2015). We then revealed an unexpected feature of E. coli LpxT enzyme, which catalyzes the transfer of the phosphate group from C55-PP to the lipid A, the endotoxin moiety of LPS, yielding C55-P and a modified form (i.e. phosphorylated) of LPS, whose role in bacterial fitness and microbe-host interaction remains unknown. This phosphotransfer reaction highlights an unexpected role of C55-PP as a phosphate donor and suggests that other C55-PP phosphatases could also exhibit similar activities with specific periplasmic acceptor molecules. Such phosphotransfer reactions could be important in fine-tuning cell envelope homeostasis in response to specific conditions. Thus, these phosphatases are not only required for the synthesis of the major “Achilles heels” of bacteria, i.e. their cell wall polymers, through the (re)generation of the lipid carrier, but they also participate in cell envelope remodeling. The present thesis project aims at deciphering the physiological role of these multiple phosphatases in E. coli, by using complementary and pluridisciplinary approaches (genetics, biochemistry, structural biology, and immunology). We will investigate the relationships between C55-P metabolism and bacterial cell physiology (cellular fitness, susceptibility to various antimicrobial agents, motility, biofilm formation, host recognition, colonization and virulence) through the differential expression of the C55-PP phosphatases (with different mutated E. coli stains). The microbe-host relationships will be explored in collaboration with the group of Ivo Boenca-Gomperts from Pasteur Institute thanks to its strong expertise of these issues. As a complementary approach, the contents and structures of the peptidoglycan and the LPS (two major immune system elicitors) in the different mutants will be determined. As being used for many purposes (the synthesis of different polymers and phosphorylation reactions), the C55-PP constitutes an important metabolic crossroad, whose regulation should be intimately linked to the control of cell envelop homeostasis. Therefore, we will explore the mechanisms of regulation of the C55-PP phosphatases. As for instance, LpxT was recently shown to be inhibited by a small membrane peptide PmrR, by a yet unknown mechanism (Kato et al., 2012). LpxT inhibition allows other LPS modifications to occur, which confer cationic antimicrobial peptide (CAMPS) resistance and host immune system evasion. We will study the mechanism of LpxT regulation at a cellular level, through the identification of environmental and genetic factors that regulate PmrR expression, and at a molecular level, to better understand the mode of action of this membrane peptide. We already demonstrated the formation of a stable LpxT/PmrR complex. These issues will be further addressed both in vivo and in vitro by using a combination of approaches (bacterial two hybrids, micro-calorimetry, pull-down, mutagenesis and crystallography). Our structural analyses are performed in collaboration with a group of biophysicists from the University of Liège (http://www.cip.ulg.ac.be), with whom we have resolved the structure of one membrane PAP2 phosphatase (El Ghachi et al., soumis) and got 2.8 Å-diffracting crystals of BacA. To further explore the involvement of C55-PP phosphatases in the modification of other cell envelope components (i.e. proteins, lipids and carbohydrates), to analyze their contribution to the synthesis of particular cell-wall polymers or to highlight new regulatory processes, we will investigate the network of protein interaction these membrane proteins are involved in. Most proteins function in multiprotein complexes to conduct specific cellular processes and the identification of new partners of a protein provides valuable insights to decipher a process in which this protein takes part. To address this issue, two complementary approaches will be used: the bacterial two hybrids (BACTH) system and the mass spectrometry analysis of purified complexes. The BACTH system allows the identification of unknown partners by high-throughput screening of interactions between a protein of interest, i.e. a C55-PP phosphatase as bait and a genomic library as prey. The large-scale mass spectrometry analysis of affinity purified proteins is performed by using His6-tagged versions of the phosphatase. The phosphatase and specific endogenous interacting proteins are then enriched in a single-step immuno-precipitation using anti-tag antibodies and the partners are identified by mass spectrometry analysis. The binary interactions emphasized by both approaches will be validated by using complementary biochemical methods (e.g. pull-down assays, microcalorimetry) and the significance of these events will then be further investigated.