Etude des protéines du bactériophage T5 impliquées dans la prise de contrôle des fonctions cellulaires de l'hôte : une voie vers le développement de nouveaux antibactériens

par Luis maria Ramirez Chamorro

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Pascale Boulanger.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    Les bactériophages, prédateurs naturels des bactéries, tuent leur hôte avec une grande efficacité. C'est au tout début du cycle viral qu'ils déjouent les mécanismes de défense et réorientent le métabolisme de leur hôte au profit de leur propre réplication. L'étude des stratégies utilisées par les phages pour prendre le contrôle de l'hôte est encore peu avancée, or elle est essentielle à plus d'un titre: i) Les gènes précoces, très variables d'un phage à l'autre, n'ont pas d'homologues connus. Ils représentent donc un réservoir de fonctions inexplorées cruciales pour la neutralisation des fonctions bactériennes. ii) En décryptant les mécanismes moléculaires de cette mise sous contrôle de l'hôte, nous pourrons identifier les fonctions bactériennes affectées par les phages, qui constituent des cibles potentielles pour de nouveaux agents antibactériens. Nous explorons les étapes précoces de l'infection en utilisant le phage T5 qui présente un mode d'infection singulier. T5, qui infecte Escherichia coli, est le seul phage connu qui injecte son ADN en deux étapes distinctes. Après fixation de T5 sur son récepteur, seulement 8% du génome pénètrent dans la bactérie, puis le transfert est stoppé. Les protéines précoces codées par cette région du génome sont alors produites et agissent sur les fonctions vitales de l'hôte: l'ADN bactérien est massivement dégradé, l ‘ARN polymérase est détournée vers la transcription des gènes viraux, les systèmes de restriction/modification et de réparation de l'ADN RecBCD sont inactivés. Deux des protéines précoces, A1 et A2, sont requises pour la reprise du transfert de l'ADN, qui a lieu après quelques minutes, permettant le déroulement complet du processus infectieux. De plus, la synthèse de la protéine A1 commande la dégradation de l'ADN bactérien. Nous disposons de phages mutés dans les gènes A1 et A2, ce qui permet d'étudier la fonction des gènes précoces et leurs interactions avec les protéines de l'hôte alors que le transfert de l'ADN est bloqué à la première étape, donc indépendamment des autres étapes de l'infection (réplication du génome et assemblage de la particule virale). Ce projet de thèse s'inscrit dans l'étude globale des protéines précoces du phage T5 et vise à comprendre les mécanismes moléculaires de détournement ou neutralisation des fonctions cellulaires de l'hôte. Le séquençage du génome de plusieurs phages apparentés à T5 a récemment montré que, en plus de A1 et A2, seulement 3 gènes précoces (Orfs 02, 05 et 07) sont conservés chez tous ces phages. Ces gènes, codés par le même opéron que A1 et A2, sont probablement essentiels à la régulation des étapes précoces de l'infection par T5. Nous caractérisons actuellement les deux protéines A1 et A2, dont les gènes ont été surexprimés chez E. coli. A1 est une DNAse qui pourrait être responsable de la dégradation du génome de l'hôte et son partenaire A2 est une protéine qui se lie à l'ADN de manière non spécifique. L'objectif de cette thèse est d'étudier la fonction des 3 protéines inconnues conservées avec A1 et A2. Ces protéines, qui n'ont pas d'homologues connus, seront produites chez E. coli, purifiées et leurs fonctions seront étudiées en combinant plusieurs approches expérimentales : i) Approches génétiques : construction de phages mutés sur les gènes de ces protéines et analyse de leur phénotype. ii) Approches biochimiques : identification des partenaires ou cibles des protéines précoces par immunoprécipitation ou chromatographie de type "tamdem affinity purification" (TAP-tag) puis analyse des complexes purifiés par spectrométrie de masse. iii) Approche transcriptomique : identification des fonctions bactériennes ciblées par les gènes précoces en analysant, au cours de l'infection, le profil de transcription des gènes de l'hôte et du phage T5 par RNAseq et qRT-PCR. iv) Approches structurales: la production des protéines recombinantes sera optimisée afin d'étudier leur structure par RMN ou cristallographie en collaboration avec des équipes partenaires de l'I2BC.

  • Titre traduit

    Characterization of bacteriophage T5 proteins involved in the host takeover: a study towards the development of new antibacterial drugs


  • Résumé

    Bacteriophages, the natural predators of bacteria, are able to kill their host with high efficiency. In the early stages of infection, phages defeat bacterial defenses and exploit specific cellular functions to serve their needs and propagate in their host. The strategies employed by phages to take over host cell resources remain obscure and have only been studied in a very limited number of phages. Investigation into these early mechanisms of infection is essential for the main following reasons: i) Phages genes expressed in the early stages are highly diverse from one phage to another and most of them have no assigned function. They thus represent a library of novel genes whose functions are crucial for host neutralization. ii) By deciphering the mechanisms of host takeover, we expect to identify host factors targeted by phages, which constitute attractive targets for new antimicrobial drugs. We use the Escherichia coli phage T5 as a model system to investigate the early stages of phage infection. T5 uses a unique two-step DNA delivery strategy that controls the timing of host function diversion. After binding of T5 to its host receptor FhuA, only 8% of the genome enters the bacterial cell before injection temporarily stops. Early proteins encoded by this region of the genome are then produced and affect vital host functions: the bacterial DNA is degraded, the RNA polymerase is redirected towards the transcription of viral genes, the restriction/modification and RecBCD DNA repair systems are inactivated. Two early proteins, A1 and A2, are required for resuming DNA transfer after a few minutes, allowing the completion of the infectious process. Moreover the synthesis of A1 controls the onset of bacterial DNA degradation. As we have T5 mutants defective in the production of A1 or A2, we can “freeze” infection just after the first step transfer of the viral genome. This gives us the opportunity to investigate the mechanisms of host takeover independently of the further steps of phage replication and assembly. This PhD project is part of a global study of phage T5 early proteins and aims at deciphering the molecular mechanisms of host resource hijacking and neutralization. The recent sequencing of several T5-like phage genomes has shown that, in addition to A1 and A2, only 3 early genes (Orfs 02, 05 and 07) are highly conserved among all T5-like phages. These genes, encoded by the same operon as A1 and A2, may be crucial for the regulation of the early stages of T5 infection. Characterization of both A1 and A2 proteins included their overexpression in E. coli cells. A1 is a DNAse that is thought to be responsible for the degradation of the host genome and its partner A2 is a non-specific DNA-binding protein. The objective of this thesis is to study the function of the three unknown proteins encoded by Orfs 02, 05 and 07 that are conserved with A1 and A2. These proteins will be produced in E. coli cells and purified, and we will study their functions by combining several approaches: i) Genetic approach: construction of phage T5 mutants affected in the unknown genes and analysis of their phenotype ii) Biochemical approach: identification of their partners or targets by immunoprecipitation or "TAP-tag" tandem affinity purification combined with mass spectrometry iii) Transcriptomic approach: analysis of the host and phage gene transcription during infection by genome-wide transcriptional profiling using RNAseq and qRT-PCR. iv) Structural approach: the production yield of recombinant proteins will be optimized with the aim to conduct their structural study by NMR or crystallography in collaboration with partner teams from the I2BC.