Dispositifs nanofluidiques à préconcentration sélective intégrant des électrodes : vers une identification rapide d'agents du biorisque.

par Sokhna mery Ngom

Projet de thèse en Physique

Sous la direction de Anne-Marie Haghiri-gosnet et de Jean Gamby.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Electrical,Optical,Bio: PHYSICS_AND_ENGINEERING , en partenariat avec Centre de Nanosciences et de Nanotechnologies (laboratoire) , Microsystèmes et nanobiotechnologies (equipe de recherche) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    Problématique : Détecter des biomolécules à l'état de traces, à des concentrations inférieures au pico-molaire, est l'un des objectifs actuels des puces à immunodétection. Les dispositifs nanofluidiques apparaissent aujourd'hui comme une voie prometteuse pour simultanément pré-concentrer et détecter des agents pathogènes du biorisque [1]. Cette électro-préconcentration est possible grâce au caractère de perméabilité sélective de la nanofente, qui se comporte sous champ électrique comme un « super-filtre» moléculaire permettant le passage ou non des biomolécules. Ce phénomène appelé Polarisation de la Concentration ionique (CP) [2-3] permet de piéger les analytes en amont ou en aval de la fente, dans l'un ou l'autre des microcanaux réservoirs (anodique ou cathodique). Notre groupe a développé un savoir-faire à la fois théorique et expérimental sur les mécanismes d'électro-préconcentration [4] dans des puces en verre, qui repose sur un 1er brevet maître DGA (thèse d'A. Plecis) [5] et un 2ème brevet CNRS sur le scellement du verre à basse température [6]. Nos travaux sur le transport sélectif au travers d'une nanofente [7] ont montré qu'il est possible de préconcentrer en quelques minutes des biomolécules d'un facteur 1000 de manière sélective, c'est-à-dire en étant capable de localiser la protéine fortement diluée en amont ou en aval de la nanofente (thèse d'A-C. Louër entre 2010-2013 cofinancée DGA/CNRS). Cette sélectivité est obtenue en ajoutant une pression hydrodynamique dans la nanostructure fluidique en sus du champ électrique. Le choix du sens d'application de cette pression additionnelle permet de choisir à volonté le réservoir en amont (ou respectivement en aval) dans lequel aura lieu la préconcentration. Des mesures récentes en spectroscopie d'impédance haute fréquence réalisées en collaboration étroite avec Jean Gamby (LISE) a permis de faire évoluer le banc expérimental pour suivre en temps réel l'évolution de la conductivité dans la nanofente. La compréhension des phénomènes physiques mis en jeu devient possible. Cette preuve de concept très encourageante nécessite d'être consolidée sur des applications concrètes du secteur biodéfense. Dans ce contexte, nous proposons, pour ce doctorat, le développement et l'étude de filtres nanofluidiques intégrant des électrodes pour lesquels la localisation du point focal de préconcentration pourrait être pilotée in-situ et en temps réel. Certains agents de la menace, pour être détectés, doivent obligatoirement utiliser les technologies de reconnaissances immunologiques. C'est le cas notamment des toxines (ricine, toxine butolique, etc…) qui sans matériel génétique, ne peuvent pas être détectées par les technologies d'amplification génétiques. La technologie d'électropréconcentration contrôlée en nanofluidique apparaît donc içi comme une technique alternative qui pourrait être utilisée, soit dans la détection de toxines (menace Nucléaire, Radiologique, Biologique, Chimique NRBC), mais aussi pour la détection d'anticorps modèles (diagnostic précoce pour le service de santé des armées). Par exemple, la détection de la procalcitonine (PCT) dans le sang des personnels éventuellement exposés à une menace bioterroriste ou endémique permettrait d'améliorer le traitement précoce des infections bactériennes. La PCT est une prohormone dont le taux sanguin s'élève et peut être mesuré en routine de façon précoce et spécifique lors d'une infection bactérienne évolutive. Elle permet en moins de détecter une exposition à un agent pathogène bactérien moins de 3 heures après l'exposition à une toxine éventuelle d'origine bactérienne. Cependant, il faut pour cela atteindre des seuils de détection très faibles. Programme de la thèse : Le travail de thèse proposé ici aura pour but le développement de circuits nanofluidiques pour étudier la pré-concentration sélective immunologique, en vue d'une identification rapide d'agents du risque biologique à très faible concentration. Les agents concernés en premier lieu seront les simulants de la menace toxinique (Ovalbumine), virale (Virus ARN MS2) et bactérienne (détection du taux de PCT dans le sang). Notre objectif sera de proposer des solutions rapides, sensibles et compatibles avec une analyse en continu pour la détection de couples « anticorps fluorescents/ cible de la menace » soit dans des biocollectats (en collaboration avec le CEB pour la fourniture de sondes, agents et bruit de fond naturels et artificiels), soit dans des matrices de type sanguine. En parallèle de la détection dans le domaine du biorisque, nous étudierons la pré-concentration sélective de biomarqueurs peptidiques de maladies rares. Nous avons déjà démarré une étude avec des peptides natifs et mutés de la protéine TTR, biomarqueurs de la maladie FAP (polyneuropathie amyloïde familiale), en collaboration avec I. Le Potier (Institut Galien, UMR CNRS 8612, Châtenay-Malabry) et C. Poüs (Centre de Prélèvement et de tri – Hôpital Béclère). Nos premières préconcentrations sélectives sont très encourageantes et montrent bien que cette technique peut être utilisée aussi pour l'analyse de biomarqueurs rares. A l'issue du travail de thèse, nous souhaitons amener la méthode de pré-concentration sélective à un stade de maturité correspondant à un démonstrateur de laboratoire.

  • Titre traduit

    Nanofluidics devices for selective preconcentration : towards a fast identification of pathogenic agents


  • Résumé

    Detecting tracks of biomolecules is an important issue for immunology. Nanofluidics appear as a promising way to simultaneously pre-concentrate and detect pathogenic agents of bio risk [1. This electropreconcentration is possible thanks to the selective permeability of the fluidic nanoslit, which behaves under electric field as a molecular "super-filter" [2-3]. It allows trapping analyses upstream or downstream to the slit, in upstream or downstream of the micro-channels reservoirs (anodic or cathodic). Our group has developed both theoretical and experimental know-how on the electrokinetic effects [4] with a first DGA patent (PhD of A. Plecis) [5] and a second one CNRS based on the sealing of the low-temperature glass [6]. Our work showed that it is possible to preconcentrate biomolecules by a factor 1000 in a selective way [7]. In others terms, it is possible to locate a protein that is strongly diluted upstream or downstream to the nanoslit (thesis of A-C. Louër between 2010-2013 cofinanced DGA/CNRS). This selectivity is obtained by adding a hydrodynamic pressure in addition to the electric field. The choice of application of this additional pressure allows choosing at will the reservoir upstream (or respectively downstream) in which will take place the preconcentration. Recent measurements performed using high-frequency impedance spectroscopy with Jean Gamby allowed recording the real time evolution of the conductivity in the nanodevice for a better understanding of physical phenomena. This very encouraging proof of concept requires to be strengthened before concrete applications in biodefense. In this context, we propose, for this PhD, the development and the study of nanofluidic filters integrating electrodes for which the location of the focal point of preconcentration could be piloted in situ and real time. The first concerned agents will be Ovalbumine, and ARN MS2 virus. Our aim will be to propose fast sensitive and compatible solutions for a continuous detection of couples " fluorescent antibodies / target" either in biocollectors (in association with the CEB for the supply of probes, natural and artificial agents and background noise), or in matrices of type blood. At the same time, we will study the selective pre-concentration of peptide biomarkers of rare diseases. We have already started a study with native and mutated peptides of TTR (Transthyretin), biomarkers of the FAP disease (Familial amyloid polyneuropathy), in collaboration with I. Le Potier (Galien, UMR CNRS 8612 institute, Châtenay-Malabry) and C. Poüs (Béclère hospital). Our first selective preconcentration experiments are very encouraging which proves that this technique can be also used for the analysis of rare biomarkers. We wish to bring this method of selective pre-concentration to a maturity stage corresponding to a demonstrator in a laboratory.