CONTRAT DOCTORAL - Peptidomique: Etudes fondamentales et appliquées à l'analyse de venins par spectrométrie de masse

par Julien Giribaldi

Projet de thèse en Ingénierie Biomoléculaire

Sous la direction de Sébastien Dutertre et de Christine Enjalbal.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques Balard , en partenariat avec IBMM - Institut des Biomolécules Max Mousseron (laboratoire) et de F12. Sciences Analytiques des Biomolécules & Modélisation Moléculaire (equipe de recherche) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    La spectrométrie de masse est la méthode de choix pour identifier et caractériser des peptides trouvés dans des échantillons biologiques. La peptidomique compte donc sur les expériences MS et MS/MS des espèces moléculaires qui sont souvent présents dans des mélanges complexes à de faibles concentrations pour déterminer les séquences peptidiques naturelles qui ne sont pas nécessairement archivées dans la base de protéines. La première partie du projet de thèse sera consacrée à la recherche fondamentale menée sur un grand nombre de peptides synthétiques disponibles dans le laboratoire selon différentes technologies MS/MS afin de contribuer à la connaissance des règles de fragmentation.L'activation vibrationelle ainsi que les méthodes d'activation électronique (métastable, CID et ETD) grâce à différentes configurations de l'analyseur de masse (MALDI-TOF/TOF, ESI-QqTOF, ESI-IT) seront étudiées. La structure des ions de fragments sera remis en question par des expériences de mobilité ionique (IM-MS). Les comportements de dissociation de peptides naturels peuvent différer de ceux tryptiques car la présence de résidus basiques fortement impliquées dans la mobilité des protons d'ionisation et la rupture des liaisons ultérieures (modèle du proton mobile) n'est pas située à l'extrémité C-terminale du peptide. Tout modèle de fragmentation spécifique qui pourrait être extrait à partir des ensembles de données MS/MS enregistrées sera très utile pour améliorer les logiciels de séquençage utilisés en protéomique et peptidomique (comme PEAKS). En outre, toute modification de l'acide aminé sur les chaînes latérales ou sur le squelette peptidique peut affecter le comportement de dissociation habituel, quelques modifications post-traductionnelles d'intérêt seront étudiées. La deuxième partie du projet de thèse portera sur une illustration d'études peptidomique en VENOMICS. En effet, les venins d'animaux sont une source riche en peptides biologiquement actifs ayant un potentiel thérapeutique. Dans ce projet, des techniques avancées MS et MS/MS (en utilisant une haute résolution ESI-SYNAPT-G2 (Waters)) sur les venins bruts digérés intact et réduit/alkylés et d'enzymes et des peptides, en combinaison avec des données de séquence transcriptomiques déjà disponibles, sera utilisé pour déterminer la totalité des séquences peptidiques matures et des modifications post-traductionnelles potentielles (qui peuvent comprendre amidification C-terminale, de l'hydroxyproline, bromotryptophan glycosylation etc ...). Le logiciel PEAKS MS sera utilisé pour faire correspondre le spectre MS/MS du peptide venin avec des séquences transcriptomiques. Les toxines sélectionnés montrant un nouvel arrangement de cystéine ou PTM seront synthétisés pour des études pharmacologiques détaillées en utilisant une combinaison de la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) et la formation sélective de pont disulfure. Les peptides seront synthétisés par étapes par neutralisation in situ Boc et Fmoc SPPS et seront purifiés par RP-HPLC et lyophilisés. Les peptides seront synthétisés avec la conformation et les ponts disulfures désirés. L'identité avec la toxine native sera vérifiée par des études de co-élution.

  • Titre traduit

    Fundamental studies and applied to the analysis of venom by mass spectrometry


  • Résumé

    Mass spectrometry represents the method of choice to identify and characterize peptides found in biological samples. Peptidomics thus rely on state-of-the-art MS and MS/MS experiments from molecular species that are often present in complex mixtures at low concentrations to determine natural peptide sequences that are not necessarily archived in protein database. The first part of the PhD project will be dedicated to fundamental research conducted on a large set of synthetic peptides available in the laboratory according to various MS/MS technologies in order to contribute to the knowledge of the fragmentation rules. Vibrational activation as well as electronic activation methods (metastable, CID and ETD) through various mass analyzer configurations (MALDI-TOF/TOF, ESI-QqTOF, ESI-IT) will be investigated. The structure of the fragment ions will be further questioned by ion mobility experiments (IM-MS). The dissociation behaviors of natural peptides may differ from tryptic ones since the presence of basic residues greatly involved in the ionizing proton mobility and subsequent bond ruptures (mobile proton model) are not located at the peptide C-terminal end. Any specific fragmentation pattern that could be extracted from the recorded MS/MS data sets will be highly valuable for improving sequencing softwares used in proteomics and peptidomics (such as PEAKS). Moreover, any modification amino acid on side-chains or on peptide backbone (such as) may affect the usual dissociation behavior, some post-translational modifications of interest will be studied. The second part of the PhD project will deal with an illustration of peptidomic studies in venomics. Indeed, animal venoms are a rich source of biologically active peptides with therapeutic potential. In this project, advanced MS and MS/MS techniques (using a high resolution ESI-SYNAPT-G2 (Waters) ) on intact and reduced/alkylated and enzyme digested crude venoms and peptides, in combination with transcriptomic sequence data already available, will be used to determine the full mature peptide sequences and potential post-translational modifications (which may include C-terminal amidation, hydroxyproline, bromotryptophan, glycosylation etc…). PEAKS MS software will be used to match venom peptide MS/MS spectrum with transcriptomic sequences. Selected toxins showing novel cysteine framework or PTM pattern will be synthesized for detailed pharmacological studies using a state-of-the-art combination of solid phase peptide synthesis (SPPS) and disulfide bond folding. Peptides will be synthesized by stepwise in-situ neutralization Boc and Fmoc SPPS and will be purified by RP-HPLC and lyophilised. Folding and disulfide formation will be achieved. Identity with the native toxin will be verified by co-elution studies.