Caractérisation structurale et fonctionnelle de régulateurs de l'homéostasie métallique chez Mycobacterium tuberculosis et recherche d'inhibiteurs associés.

par Lucie Arnaud

Projet de thèse en Biologie Structurale et Nanobiologie

Sous la direction de Patrice Catty (edcsv).

Thèses en préparation à Grenoble Alpes , dans le cadre de Chimie et Sciences du Vivant , en partenariat avec Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux (laboratoire) depuis le 20-09-2016 .


  • Résumé

    Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un pathogène intracellulaire responsable de la tuberculose (1,5 millions de morts en 2015 (WHO)), dont la virulence est directement liée à l'homéostasie des métaux. En effet, pour survivre et proliférer à l'intérieur des macrophages, Mtb doit faire face à une carence en fer et une surcharge en zinc et cuivre provoquées par l'hôte en réponse à l'infection. La bactérie sollicite pour cela des transporteurs, déjà étudiés au laboratoire (ANR P.Catty/O.Neyrolles ISPB UMR5089 Toulouse), des chaperonnes, des chélateurs et des régulateurs transcriptionnels. Ces derniers, similaires à ceux analysés durant mon stage M2, englobent les protéines FurA, FurB et IdeR impliquées respectivement dans le stress oxydant, l'homéostasie du zinc et celle du fer. Un quatrième régulateur, SirR, est présent mais son rôle n'est pas encore élucidé. Le but de la thèse est l'identification des acteurs de l'homéostasie des métaux chez Mtb pour en faire des cibles thérapeutiques potentielles anti-virulence. Pour atteindre cet objectif, un des volets du projet consistera en la caractérisation structurale et fonctionnelle de métallorégulateurs dont le rôle est crucial dans la prolifération bactérienne post-infection et dans le contrôle de l'expression des transporteurs. Les structures des protéines IdeR et FurB sont déjà connues celles de FurA et SirR ne sont pas encore résolues. Une des premières étapes consistera à produire, purifier et caractériser ces protéines en solution avant de débuter des expériences de cristallogenèse. Un autre volet portera sur la recherche de nouveaux acteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie des métaux. Des études transcriptomiques par PCR quantitative couplées à une analyse de la composition métallique globale (ionome) par ICP-AES seront réalisées, tout d'abord, sur la souche Mycobacterium smegmatis au laboratoire, et ensuite sur Mtb en collaboration avec O. Neyrolles. Différentes conditions seront testées : souche sauvage, privée de métallorégulateurs (KO), stress métallique ou pas et en conditions d'infection ou non. Ces données nous permettront d'établir une carte détaillée des régulations, notamment celles des transporteurs, dans des conditions de stress et ainsi, d'identifier de nouveaux acteurs potentiels impliqués dans l'homéostasie des métaux. Dans un dernier volet, les inhibiteurs actuellement en cours d'étude au sein de l'équipe seront testés sur les acteurs essentiels, à la fois in vitro au laboratoire et in vivo (coll O. Neyrolles). Cette approche visant à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques est une démarche originale et pluridisciplinaire qui n'a pas encore été abordée à ce jour et représente, de ce fait, une piste prometteuse dans la lutte contre Mtb.

  • Titre traduit

    Structural and functional characterization of metal homeostasis regulators of Mycobacterium tuberculosis and search for inhibitors


  • Résumé

    The emergence of antibiotic resistance in intra-cellular pathogenic bacteria like Mycobacterium tuberculosis (Mtb) (1,5M deaths due to tuberculosis WHO 2015) requires the imminent set up of new therapeutic approaches. In Mtb, pathogenicity is intimately linked to metal homeostasis. Indeed, to survive in the macrophage, Mtb must combat iron depletion and Zn/Cu overload triggered during host response to infection. In that context, key actors of Mtb survival are metal transporters induced upon infection (ongoing ANR project O. Neyrolles, P. Catty, P. Brodin). More generally, adaptation of pathogenic bacteria to metal environment changes induced by innate antimicrobial host defence mechanisms involves metal-dependent transcription regulators that are therefore promising therapeutic targets to combat bacterial virulence. In bacteria, DtxR and Fur (Ferric uptake regulator) are important iron sensitive transcriptional regulators involved in iron uptake and storage. These metal-transcriptional regulators and another one, Zur (Zinc uptake regulator) that senses intracellular zinc, are implicated in bacterial metal homeostasis but also virulence. In Mtb, two Fur-like proteins have been identified, FurA involved the response to oxidative stress and FurB (Zur-like) involved in zinc homeostasis. In addition, Mtb also contains IdeR (DtxR-like) whose structure has been solved in 2004 in complex with DNA. Mtb FurB structure has been obtained in 2006. The structure of Mtb FurA is still unknown. The aim of the PhD project is to identify and characterize a new set of molecules able to specifically inhibit the iron/zinc sensitive transcription regulators FurA, FurB and ideR and thereby decrease Mtb virulence. This project will benefit from our great experience in the field. Recently, weevidenced, a new family of tetrameric Fur proteins and solved the structure of one of them from Francisella tularensis in presence of the physiological iron. We also aimed at deciphering the structure-function relationships between Fur and inhibitors developed in our laboratory (Abed Mol.Cell.Prot 2007; Cissé ACS Chem Biol 2014 and Mathieu ACS Chem Biol 2016 in revision). In the project, the efficiency of the inhibitors will be tested in different systems in vivo in collaboration with O. Neyrolles (Team IPBS -UMR 5089 in Toulouse) which has the required expertise: i / M. tuberculosis in different growth conditions that mimics the environment of tuberculous granulomas, ii / on murine macrophages mimicking the presence of T lymphocytes, iii / mice after intranasal infection. The growth inhibition capacity (MIC) of the molecules of interest will be compared to that of tuberculosis known as isoniazid or rifampin. The different tasks of the project will be the following: -Identification of potential molecule of interest byin silico screening of virtual chemical library in the potential inhibition pocket of the structurally characterized ideR and Mtb-Zur -Determination of high-resolution structure of Mtb-FurA in presence of iron and DNA studies of inhibition of Mtb metal-transcriptional regulator in vitro at the LCBM and in vivo in collaboration with the group of Olivier Neyrolles -transcriptomic analysis by Q-PCR of the regulation of the metal transporters expression in wild type and deletion mutants of the regulators.