Développement méthodologiques et informatiques pour la cryo-microscopie électronique en transmission à balayage des spécimens biologiques

par Amandine Verguet

Projet de thèse en Physique

Sous la direction de Sergio Marco garrido.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Sciences Chimiques : Molécules, Matériaux, Instrumentation et Biosystèmes , en partenariat avec Chimie, modélisation et imagerie pour la biologie (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-09-2016 .


  • Résumé

    La compréhension de fonctions biologiques passe par la caractérisation ultra-structurale des cellules et complexes macromoléculaires. La microscopie électronique à transmission (TEM) donne l'accès aux structures tridimensionnelles des composantes structurales biologiques, soit par l'analyse de particules isolées (pour les protéines et complexes macromoléculaires) soit par la tomographie électronique (pour les structures uniques telles que les organelles), est de nos jours l'outil de choix pour réaliser cette caractérisation à haute résolution. Puisque que le matériel biologique est essentiellement constitué d'eau, son observation, pour obtenir des informations ultra-structurales proches de l'état natif, passe par sa préparation dans un état hydraté congelé (cryo-TEM). En plus des approches classiques en cryo-TEM, il a été proposé en 2010 de réaliser des acquisitions en mode balayage en transmission (STEM) (Gee et al. 2010). Ce mode permet d'avoir un meilleur rapport signal-sur-bruit et un meilleur contraste que le mode TEM. Egalement, à l'aide de détecteurs (HA)ADF il est possible en mode STEM de réaliser du contraste atomique donnant ainsi accès à la distribution des éléments chimiques dans des échantillons. Néanmoins ce n'est qu'en 2014 que il a été possible pour la première fois d'utiliser le mode STEM sur des échantillons hydratés et congelés pour des acquisitions tomographiques (Wolf et al. 2014). Cependant, pour acquérir des images de qualité suffisante pour obtenir des reconstructions tridimensionnelles à très haute résolution il faut maitriser la dose d'électrons utilisée pour imager l'échantillon sans l'endommager. D'autre part, dans d'autres mode d'imagerie (IRM par exemple), depuis quelques années est apparue la possibilité de faire des acquisitions « sparse » avec une acquisition aléatoire d'une partie de l'image et à l'aide d'algorithmes de reconstruction de type « compressed sensing » il est possible de récupérer une reconstruction complète. Ce type d'acquisition pourrait être intéressant en cryo-tomographie pour réduire l'irradiation des échantillons et ainsi mieux les préserver. Cependant une acquisition sparse n'est pas possible en cryo-TEM puisqu'un champ de vue entier est acquis. Par contre en STEM et cryo-STEM, il est possible de n'acquérir qu'une partie de l'image de façon aléatoire. Il est donc nécessaire de définir des procédures optimisées d'acquisition, ainsi que des algorithmes d'alignement et de reconstruction pour la cryo-STEM, soit en balayage continue, soit en balayage aléatoire, en les optimisant pour le matériel biologique hydraté et congelé.

  • Titre traduit

    Methodological and computing development for cryo-STEM tomography of biological sample.


  • Résumé

    The understanding of biological functions requires the ultra-structural characterization of cells and macromolecular complexes. This characterization using transmission electron microscopy (TEM) allows to get the three dimensional structures of the biological structural components, either by single particule analysis (for isolated particules of proteins and macromolecular complexes) or by electron tomography (for unique structure such as organels). This kind of analysis is nowadays a tool of choice to achieve the high-resolution characterization. Given that the biological sample is mainly composed of water, the preparation of the sample in a frozen hydrated state is needed to obtain the ultra-structural informations in its native state(cryo-TEM). In addition to classical cryo-TEM approaches, another method using scanning transmission electron microscopy (STEM) has been achieved in 2010 (Gee et al. 2010) and allows to acquire images with a better signal-to-noise ratio and a better contrast than in TEM. Thanks to the (HA)ADF detectors, it is also possible to perform Z-contrast acquisition giving access to the chemical distribution in a sample. Anyway, the first usage of the STEM mode for acquisition in tomography on frozen hydrated samples has been achieved in 2014 (Wolf et al. 2014). Nevertheless, in order to acquire images of sufficient quality and to obtain three-dimensional reconstructions at very high resolution, one must master the electron dose used to image the sample without damage. Since a few years, in other imaging mode like MRI, it has been shown that "sparse" acquisition, relying on the acquisition of few points from the images taken randomly, can provide very good results by using reconstruction algorithms named "compressed sensing". This kind of acquisition is interesting in cryo-tomography in order to preserve the sample by reducing radiations. Sparse acquisition is not feasible with cryo-TEM because the whole field of view is acquired. Using STEM and cryo-STEM, sparse acquisition becomes feasible. The main objectives of this thesis are to determine optimized procedures for acquisition as well as alignment and reconstruction algorithms for the cryo-STEM, either by continuous scanning or by random scanning. The procedures will be optimized for frozen and hydrated biological samples.