Développements de méthodes de microscopie de fluctuations de fluorescence : application à l'optogénétique, aux mesures de diffusion dans la cellule et de concentration de protéines sur substrats

par Dwiria Wahyuni

Projet de thèse en Physique pour les Sciences du Vivant

Sous la direction de Antoine (phys) Delon et de Irène Wang.

Thèses en préparation à Grenoble Alpes , dans le cadre de Physique , en partenariat avec Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (laboratoire) et de MOTIV : Matériaux, Optique et techniques instrumentales pour le vivant (equipe de recherche) depuis le 27-09-2016 .


  • Résumé

    La spectroscopie de fluctuations de fluorescence (FFS) tire parti des signaux de fluorescence émis par les molécules qui traversent le volume d'observation d'un microscope. Une analyse spatiale et/ou temporelle des fluctuations de ces signaux permet de mesurer la dynamique (le cas échéant) et la concentration moléculaire. Dans ce projet, nous allons déployer des outils d'analyse FFS, comprenant notamment les techniques appelées "Image Correlation Spectroscopie" (ICS) et " Raster Image Correlation Spectroscopy " (RICS). Ces mesures seront effectuées sur un microscope confocal. Tout d'abord, nous nous sommes intéressés à un système optogénétique utilisant, comme protéines photosensibles pouvant être activées ou inactivées par illumination, le système de CRY2 / CIBN. Nous souhaitons, d'une part optimiser les paramètres d'illumination et d'autre part mieux caractériser les processus intracellulaires en jeux au niveau optogénétique. CRY2 est une protéine cytosolique tandis que CIBN diffuse dans la membrane plasmique. Le comportement de diffusion de ces deux protéines sera analysé par RICS où nous corrélons spatialement (et donc temporellement) l'intensité d'un pixel à l'autre d'une image acquise par balayage. Enfin, nous appliquerons la méthode de fluctuations de fluorescence pour quantifier la densité surfacique de protéines, constitutives de la matrice extracellulaire, immobilisées sur un substrat 2D. L'approche que nous utilisons combine ICS et photoblanchiment pour améliorer la qualité de la mesure.

  • Titre traduit

    Investigation of fluorescence fluctuation microscopy methods to assess processes such as optogenetics, diffusion in the cell, and to measure protein deposition in substrates


  • Résumé

    Fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) takes advantage of fluorescence signals emitted by molecules that pass through an observation volume of a microscope. A spatial and/or temporal analysis of the fluctuating fluorescence signal allows us to extract molecular dynamics (when appropriate) and the molecular concentration. In this project, we will deploy FFS analysis tools including Image Correlation Spectroscopy (ICS) and Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS). These measurements will be performed on a confocal microscope. Firstly, we will study an optogenetic system which based on photosensitive proteins that can be either activated or inactivated upon illumination, a CRY2/CIBN system. We expect, in one part to optimize illumination conditions and in another part to characterize the intracellular process at the optogenetic level. The CRY2 is plasma protein while CIBN is cytoplasmic. The diffusional behavior of both proteins will be revealed by using RICS where we spatially correlate spatially (and so temporally) the intensity in one pixel to the next one in an image acquired by scanning. Lastly, we will apply the fluctuation method to quantify the surface density of proteins which are components of the extracellular matrix, which immobilized on a 2D substrate. The approach that we use is a combination of ICS and photobleaching to improve the quality of the measurements.