Analyse de l'impact de Parvimonas micra sur les cellules coliques de l'hôte

par Emma Bergsten

Projet de thèse en Pathologie et recherche clinique

Sous la direction de Iradj Sobhani et de Philippe Sansonetti.

Thèses en préparation à Paris Est , dans le cadre de SVS - Sciences de la Vie et de la Santé , en partenariat avec Equipes d'accueil ( EA) UPEC - Henri Mondor ( CEPIA, ARCHE, EC2M3, DYNAMIC, EpiDermE, BIOTN) (laboratoire) et de Early detection of Colonic Cancer by using Microbial & Molecular Markers” (EC2M3) (equipe de recherche) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer en terme de fréquence et le second en terme de mortalité à travers le monde. Au cours de ces dernières années, le développement des technologies de séquençage haut débit basées sur l'analyse des séquences d'ADN à partir de selles et en s'affranchissant de la culture bactérienne, a permis de mettre en évidence un déséquilibre du microbiote intestinal chez les individus atteints de CCR par rapport à des individus sains en abondance et en diversité bactérienne, appelé dysbiose. Plusieurs taxons bactériens ont ainsi été retrouvés préférentiellement associés au CCR. Dans la continuité d'une étude réalisée par notre laboratoire (Zeller et al 2014), basée sur l'analyse métagénomique Whole genome à partir des selles d'une imposante cohorte de patients atteints de CCR, un panel de 22 bactéries sur ou sous-représentées a été caractérisé. Nous avons à présent pu distinguer deux classes de bactéries impliquées : des bactéries commensales de la flore orale, en particulier des bactéries GPAC (Gram-Positive Anaerobic Cocci) et des bactéries SRB (Sulfate-reducing bacteria), capable de réduire les composés sulfatés de l'alimentation en hydroxyde de sulfure, composé toxique pour les cellules épithéliales. Ces analyses corrélatives ne nous indiquent pas si ces groupes particuliers de bactéries retrouvées associées au CCR sont une conséquence des changements observés dans le microenvironnement tumoral ou bien si celles-ci sont directement impliquées dans la promotion et/ou l'initiation de la carcinogenèse colorectale. L'objectif général de ce travail est d'étudier le potentiel causal de ces bactéries dans la genèse du cancer colorectal. Le choix d'une bactérie candidate, nous permettra d'étudier in vitro son impact sur les cellules épithéliales coliques de l'hôte. Pour répondre à cet objectif, nous avons choisi d'étudier une bactérie candidate : Parvimonas micra. En effet, P. micra est une bactérie GPAC commensale de la flore orale et capable de réduire les composés sulfatés en hydroxyde de sulfure ; elle est donc représentative des deux groupes. L'approche expérimentale consiste dans un premier temps à caractériser Parvimonas micra, bactérie anaérobie qui nécessite des conditions de culture strictes, puis à co-cultiver P. micra avec des cellules Humaines coliques in vitro: lignées cellulaires immortalisées et lignées primaires. L'analyse phénotypique et moléculaire des cellules sera réalisée. Le taux de survie, la vitesse de croissance et leurs morphologies seront suivis. De plus, nous analyserons par RT-qPCR, la prolifération cellulaire (cyclineD1), le niveau de différentiation (ATOH1), l'apoptose (BAX), l'activation immunitaire innée (DEFB2, IL6), le stress du RE (HSPA5) et les cellules souches (Lgr5). La sécrétion de cytokines dans le surnageant sera dosée (IL-6, IL-8, TNFa). Le niveau global de méthylation de l'ADN sera analysé par dosage des cytosines méthylées (5-mC), et le statut méthylé des promoteurs d'un panel de gènes suppresseurs de tumeurs sera analysé par Methylight qPCR (WIF1, MLH1, APC, CDKN2A, NEUROG1, IGF2, SFRP2, SEPT9). Les taux de cassures doubles brins de l'ADN seront également estimés par marquage IF dirigé contre γH2AX en utilisant une souche d' E. coli à colibactine + en tant que contrôle. De plus, la capacité d'adhésion et d'invasion de P. micra aux cellules épithéliales sera analysée.

  • Titre traduit

    Analysis of Parvimonas micra's impact on host colonic cells


  • Résumé

    Colorectal cancer (CRC), with more than one million new cases and nearly 600,000 death each year worldwide, is a major public health concern. Less than 5% of case may be explained by a constitutional genetic susceptibility, suggesting the major role for the environmental factors. Gut microbiota, as the interface between environment and gastrointestinal epithelium, could participate in colorectal carcinogenesis. The recent development of metagenomics approaches allowed fecal microbiota entire characterization in healthy patients, thereby enabling its study in pathological situations such as the CRC. Indeed, a significant fecal microbiota abnormality, called dysbiosis, was found in patients with CRC. A shortlist of bacteria differentially expressed between healthy individuals and individuals with CRC, was discovered. However, taken individually these bacteria can't explain every cases of CRC. In addition, the CRC is a very heterogeneous disease (clinicopathological, tumor stages, molecular and immune). This project aims to characterize the smallest bacterial community representative of each heterogeneity factor in humans. Then, validate and examine mechanisms of actions in experimentals models (cellular and murine). Our long-term objective is to develop prevention and screening measures to improve CRC care.