Etude de l'impact de la sur-expression de la partie C-terminale de LRRK2 mutée G2019S dans les neurones dopaminergiques de la substance noire.

par Noemie Cresto

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Emmanuel Brouillet.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Signalisations et Réseaux Intégratifs en Biologie , en partenariat avec Laboratoire des Maladies Neurodégénératives : mécanismes, thérapies, imagerie (MIRCen) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement opérateur d'inscription) .


  • Résumé

    Les protéines alpha-synucléine (α-syn) et leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) sont deux protéines ayant un rôle majeur dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson (MP) et interviennent aussi bien dans les formes dites sporadiques que dans les formes familiales. La mutation G2019S du gène codant pour LRRK2 est la mutation la plus fréquente. Cette mutation induit une augmentation de l'activité kinase de LRRK2 qui conduit à sa toxicité. Plusieurs hypothèses convergent vers l'idée que LRRK2 et l'α-syn interagiraient pour conduire à la dysfonction et/ou la mort des neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire (SNc) dans la MP. Dans la première partie de cette étude, différentes formes sauvage (WT) ou mutée (G2019S) de LRRK2 ont été surexprimées spécifiquement dans les neurones de la SNc via l'utilisation de vecteurs lentiviraux (LV) et adéno-viraux associés (AAV). La question principale de cette étude était d'évaluer si l'expression spécifiquement neuronale de LRRK2 induisait la dégénérescence des neurones DA de la SNc. Nous avons généré des constructions comportant uniquement la partie C-terminale de LRRK2 (ΔLRRK2) en aval du domaine LRR. In vitro, le fragment ΔLRRK2G2019S présente une activité kinase supérieure au fragment ΔLRRK2WT avec une augmentation d'activité comparable à la forme entière de LRRK2. In vivo, six mois après l'injection (PI) de ΔLRRK2 WT ou G2019S dans la SNc, les mesures du nombre de neurones montrent que seul le fragment ΔLRRK2G2019S induit une mort neuronale significative (30%) comparé à la forme ΔLRRK2WT, uniquement lorsque l'expression est générée via des vecteurs AAV. Ces résultats suggèrent que l'expression purement neuronale d'un fragment contenant le domaine kinase de LRRK2 est suffisante pour induire une dégénérescence de la SN. Dans la seconde partie du projet, nous avons étudié l'hypothèse que ΔLRRK2G2019S via son activité kinase amplifiée, pourrait augmenter la toxicité le l'α-syn mutée A53T. Pour répondre à cette question, les vecteurs AAV codant pour ΔLRRK2 G2019S ou une forme inactive de la kinase (ΔLRRK2G2019S/D1994A), et celui codant pour l'α-syn A53T ont été co-injectés dans la SNc. Les analyses réalisées à 6 et 15 semaines PI montrent que ΔLRRK2G2019S augmente la mort neuronale induite par l'α-syn A53T d'une manière kinase dépendante. Tous ces résultats supportent l'hypothèse que l'existence d'une interaction fonctionnelle entre LRRK2 et l'α-syn pourrait jouer un rôle fondamental dans la physiopathologie de la MP offrant des possibilités de stratégie de neuroprotection ciblant l'interaction LRRK2/α-syn.

  • Titre traduit

    Effect of the overexpression of the C-terminal fragment of LRRK2 harboring the G2019S substitution in dopaminergic neurons


  • Résumé

    Alpha-synuclein (α-syn) and leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) proteins are likely to play crucial roles both in sporadic and familial forms of Parkinson's disease (PD). The most prevalent mutation in LRRK2 is the G2019S substitution which induces neurotoxicity through a marked increase of its kinase activity. A possible interplay between LRRK2 and α-syn may be involved in the dysfunction and/or in the death of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra (SNc) in PD. In the first part of the study, we evaluated whether the overexpression of LRRK2G2019S using lentiviral vectors (LVs) and adeno-associated virus (AAV2/9), which can overexpress transgenes selectively in neurons could trigger neurodegeneration in the SNc, in other words, whether cell-autonomous mechanisms are sufficient to trigger the degeneration of DA neurons. We generated constructs corresponding to the C-terminal domain of LRRK2 (ΔLRRK2) containing the kinase domain. Results of assays performed in vitro indicated that ΔLRRK2 retains biochemical properties of full length LRRK2. Six months after the stereotaxic injection of LV-ΔLRRK2G2019S in the SNc, the number of DA neurons was unchanged, however, the infection of the SNc with AAV-ΔLRRK2G2019S but not with AAV-ΔLRRK2WT induced a significant ~30% loss of DA neurons. These results suggested that neuronal overexpression of the mutant kinase domain of LRRK2 was sufficient to trigger neurodegeneration in the SNc in the adult brain. In the second part of the study, we aimed at studying whether ΔLRRK2G2019S could increase the neurotoxicity of a mutant form of α-syn (A53T mutation) in vivo in DA neurons. We used a co-infection approach with AAV vectors encoding the α-synA53T, and ΔLRRK2 G2019S alone or with the D1994A mutation (ΔLRRK2G2019S/D1994A) that inactivates the kinase activity of LRRK2. AAVs were stereotaxically co-injected into the rat SNc and histological evaluation was performed at 6 and 15 weeks (early and late time points) post-infection. Results showed that ΔLRRK2G2019S increased the toxicity of α-synA53T in a kinase-dependent manner. Altogether, the present study supports the hypothesis that a functional interaction between LRRK2 and α-syn may play a key role in PD pathogenesis. The new “double hit” model we developed in rats may be of interest to test novel neuroprotective strategies targeting LRRK2/α-syn in vivo.