Etude de l'impact de la sur-expression de la partie C-terminale de LRRK2 mutée G2019S dans les neurones dopaminergiques de la substance noire.

par Noemie Cresto

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Emmanuel Brouillet.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Signalisations et Réseaux Intégratifs en Biologie , en partenariat avec Cea Cnrs UMR 9199 - Laboratoire des Maladies Neurodégénératives: mécanismes, thérapies, imagerie (MIRCen) (laboratoire) , Cell-cell interactions in neurodegeneration (equipe de recherche) et de université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 09-12-2013 .


  • Résumé

    La Maladie de Parkinson (MP) est une maladie neuro-dégénérative du système nerveux central, la seconde après la maladie d'Alzheimer. Physiologiquement, nos mouvements sont régis par la dopamine produite au sein de la substance noire (SN). En condition de MP quand ces cellules qui produisent la dopamine meurent, on voit apparaître les symptômes de la MP. La MP se caractérise par différent symptôme , essentiellement des symptômes moteurs : tremblement au repos , rigidité posturale, trouble de l'équilibre, lenteur d'exécution des mouvements, mais aussi des symptômes non moteur tels qu'une posture voûtée, des troubles du sommeil, une dépression…La MP se caractérise aussi par des inclusion circulaire de la protéine a-synucleine. A l'heure actuelle, il n'existe aucun traitement curatif de la maladie, mais il existe toutefois des thérapies médicamenteuses ou non médicamenteuses (opération chirurgicale) qui ont pour but d'atténuer les symptômes mais ne stoppe pas la dégénérescence. Cette maladie est complexe et multifactorielle. Néanmoins, les causes exactes restent mal connues. S'il y a une composante génétique avérée (10% des patients MP), des facteurs environnementaux pourrait également être impliqués : neurotoxine, pesticides… L'identification de causes génétiques de la maladie a permet d'ouvrir de nouvelles voies pour comprendre les mécanismes responsables de la pathologie et trouver de nouvelles thérapies. En ce sens nous travaillons sur l'étude de la protéine Leucine-rich-repeat Kinase 2 (LRRK2). Cette protéine possède environ 40 sites de mutations dont 6 de ces sites sont décrits comme pathogéniques et liés à la MP. La mutation la plus fréquente est la mutation G2019S qui se situe dans la boucle active de la protéine qui est le domaine kinase conférant à celui-ci une activité kinase de phosphorylation de substrat augmentée, ce qui est celon la littérature, toxique pour les cellules de la substance noire. Afin d'étudier cette toxicité soutenu par le domaine kinase, le laboratoire avait développé avant mon arrivée des vecteurs viraux (AAV et lentivirus) qui expriment différentes formes de LRRK2 : 1-Vecteur codant pour le domaine kinase sauvage ou muté G2019S de la protéine, appelé frangment « KIN ». 2-Vecteur codant pour le domaine KIN plus un domaine adjacent régulateur de l'activité kinase, appelé fragment « RCK ». 3-Vecteur codant pour RCK auquel nous avons rajouté un domaine qui est supposé important pour l'interaction de LRRK2 avec ses substrats, le domaine WD40. Appelé fragment « RCK WD40 ». Ces vecteurs viraux sont injectés dans la substance noire des animaux par stéréotaxie. Les animaux sont soumis à une batterie de test qui ont pour but de tester l'activité motrice à différents temps post injection. Les animaux sont sacrifiés 25 semaines après l'injection pour études histologiques, biochimiques, et moléculaires. Ce modèle ne mime pas la mort des neurones de la SNc qui est caractéristique de la maladie. Cependant, il permet d'étudier in vivo des aspects de LRRK2 jusqu'alors inexplorés. Dans le présent projet nous prenons avantage des outils de vectorisation développés pour les études LRRK2 pour aborder de manière originale l'interaction de LRRK2 mutée avec l'-syn. Une question majeure subsiste quant aux formes génétiques de la MP liées aux mutations de LRRK2 : l'-syn est-elle un « catalyseur » pour que la maladie s'exprime chez les patients LRRK2 ? Les mutations LRRK2 induisent-elles progressivement la synucléinopathie ? A ce jour, il n'existe pas de preuves formelles que LRRK2G2019S puissent « démarrer / favoriser » la synucléinopathie. Les implications thérapeutiques liées à ces questions sont pourtant majeures. En effet, les inhibiteurs de LRRK2, pourraient ralentir l'évolution de la MP liée à la mutation de LRRK2. En corolaire, l'activité endogène « normale » de LRRK2 pourrait aggraver l'initiation et la propagation de la -synucléinopathie. Si tel était le cas, les inhibiteurs de LRRK2 pourraient ralentir la progression de l'-synucléinopathie dans les cas sporadiques de MP. Ainsi la nature de l'interaction LRRK2/-syn est très débattue et le rôle précis de l'activité kinase de LRRK2 dans cette interaction reste à démontrer. L'objectif du projet est d'étudier l'hypothèse que l'activité kinase de LRRK2G2019S produirait un effet « accélérateur » de la synucléinopathie générée par l'expression d'-syn humaine (sauvage ou mutée A53T) au niveau de la SNc.

  • Titre traduit

    Effect of the overexpression of the C-terminal fragment of LRRK2 harboring the G2019S substitution in dopaminergic neurons


  • Résumé

    Mutations in the leucine-rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) are the most common genetic causes of autosomal dominant Parkinson's disease (PD), which is characterised by a loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (SNc) and the presence of the fibrillar cytoplasmic aggregates of α-synuclein (Lewy-bodies and neurites). We aimed at studying the neuronal consequences of an increase in the kinase activity of G2019S-LRRK2 mutation, a phenomenon that is considered to be central in the triggering of neurodegeneration. To specifically address this question, we evaluated the potential neurotoxicity of lentiviral (LV) and adeno-associated viral (AAV) vectors expressing three different fragments of the C-terminal part of wild type (WT) or G2019S mutant LRRK2: 1) the kinase domain (K), 2) the kinase domain plus its regulatory ROC-COR domain (RCK) and 3) the RCK domain with the C-terminal WD40 domain (RCK-WD40). The fragments were evaluated in kinase activity assay in vitro (autophosphorylation and substrate phosphorylation), showing that the mutation G2019S induced a major increase of the kinase activity of the RCK-WD40 domain. Viral vectors coding the different constructs were injected in the rat SNc. Histological evaluation showed that 20-60% of the tyrosine-hydroxylase-(TH)-positive DA neurons were transduced. Longitudinal evaluation (up to 25 weeks post transduction) of the rats injected with LVs and AAVs coding RCK-WD40 (WT) or G2019S fragments showed no performance change in motor tests, and no loss of TH-positive DA neurons in G2019S group as compared to controls. However, overexpression of RCK-WD40-G2019S produced significant transcriptomic changes as compared to the WT fragment and a Dead-Kinase (G2019S/D1994A). These observations indicated that this Cterminal fragment of LRRK2 was functional and produced cellular disturbances in vivo that, however, were sub-toxic at the time points considered after infection. We hypothesized that the lack of neurotoxicity of RCK-WD40-G2019S in DA neurons in rodents may be related to the absence of intrinsic factors rendering DA neurons exquisitely vulnerable in patients with the G2019S mutation. One possibility is that human alpha-synuclein may play a permissive or accelerating role in neurodegeneration induced by LRRK2-G2019S. To study this hypothesis, we are examining whether G2019S RCK-WD40 could increase the neurotoxicity of human alpha-synuclein in DA neurons. We will present preliminary results from ongoing experiments where rat DA neurons have been co-infected with AAV-G2019S-RCK-WD40 and AAV- A53T-alpha-synuclein.