Transport cellobiose médié par PTS et son effet sur l'expression du gène de virulence chez Listeria monocytogenes

par Minh thanh nguyen Cao

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Josef Deutscher.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Agriculture, Alimentation, Biologie, Environnement, Santé (2015-.... ; Paris) , en partenariat avec MICALIS- Microbiologie de l'Alimentation au service de la santé humaine (laboratoire) et de AgroParisTech (France) (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-09-2012 .


  • Résumé

    Listeria monocytogenes est une bactérie à Gram+, ubiquiste, pathogène intracellulaire d'origine alimentaire, responsable chez l'homme, de nombreuses infections telles que les infections foeto-maternelles, des méningo-encéphalites et des septicémies. La bactérie utilise préférentiellement le cellobisoe qui est transporté via le système phosphoenolpyruvate:sucre phsosphotransferase (PTS). L'entrée du cellobiose fait intervenir par deux PTS de la classe lactose/ cellobisoe. L'expression des gènes codant ces transporteurs est contrôlée par le régulateur transcriptionnel CsrA. CsrA appartient à la famille des régulateurs de transcription à PRD (PTS Regulation Domain). Il est constitué en N-terminal d'un domaine de fixation à l'ADN et d'un motif Walker A et en C-terminal de deux PRDs entre lesquels sont insérés les domaines EIIACel et EIIBCel. Le gène csrA (lmo1721) est localisé en aval de l'opéron lmo1719-lmo1720, codant le PTSCel. La délétion de CsrA empêche l'expression de l'opéron csrA et l'effet répressif du cellobiose sur les gènes de virulence. La présence des sucres rapidement métabolisables, comme le glucose, le fructose, le cellobiose ou le mannose, dans le milieu de croissance réprime fortement l'expression des gènes de virulence de ce pathogène. L'expression de la plupart de ces gènes est contrôlée par l'activateur de transcription PrfA, un régulateur Crp-like. Un rôle potentiel du PTS dans la régulation de PrfA a également été mis en évidence par des tests de dosage β-D-glucuronidase à partir de cultures bactériennes réalisées en milieux liquides ou sur géloses et aussi par des tests de qRT-PCR (pour l'expression des gènes actA et hly). Ces tests ont été réalisés à partir de la souche L. monocytogenes AML73 (portant la fusion Phly-gus) et des mutants csrA, mutants de composants du PTSCel (construits dans cette souche). Les mutations csrA, lmo2684 (EIICCel) entraînent une augmentation de l'activité de PrfA et une augmentation de l'expression des gènes de virulence PrfA-dépendants (hly-codant pour la listériolysine et actA-codant pour l'actine-α) est également observée dans les mutants csrA, lmo2684 (EIICCel). Une protéine Lmo1095 a été récemment identifiée qui joue un rôle central dans l'inhibition de la virulence par les sources de carbone. Nos résultats préliminaires indiquent que cette protéine interagit avec un régulateur des gènes de virulence. L'importance de cette protéine inhibitrice de la virulence pour le développement de nouveaux agents anti-infectieux est évidence.

  • Titre traduit

    PTS-mediated cellobiose transport and its effect on virulence gene expression in Listeria monocytogenes


  • Résumé

    Listeria monocytogenes transports cellobiose mainly via a PEP:carbohydrate phosphotranseferase system (PTS). Its utilization exerts a strong repressive effect on listerial virulence gene expression. Growth on cellobiose induces the expression of the celBCA1 and celBA2 operons as well as lmrG01989 (EIICCel), which encode the soluble EIIACel1 and EIIBCel1 components and the transporter EIICCel1, the EIIACel2 and EIIBCel2 proteins, and a second EIICCel, respectively. Growth on glucose strongly repressed the expression of these genes. Deletion of the EIICCel1-encoding celC1 or of both, celA1 and celA2, significantly slowed cellobiose consumption. The bicistronic operon celBA2 is located downstream from csrA, which codes for a LevR-like transcription activator. Expression of the three cellobiose-induced transcription units depends on CsrA, which itself is activated via phosphorylation by EI and HPr at His550. In contrast, phosphorylation at His823, which is catalyzed by both, P~EIIBCel1 and P~EIIBCel2, inhibits CsrA activity. Preventing this phosphorylation by replacing His823 with Ala or deleting the two EIIACel- or EIIBCel-encoding genes caused constitutive expression of all three CsrA-controlled transcription units. Mutants, that exhibit slow cellobiose consumption, were relieved from cellobiose-mediated virulence gene repression, whereas glucose still repressed them, indicating that none of the PTS components required for efficient cellobiose transport is involved in PrfA regulation. The gene lmo1095 of strain AML73, which codes for an EIIBCel-like PTS component, attracted our attention, because compared to other EIIBCel it contains a 28 amino acids long insert, which suggested that it might it might be involved not only in PTS-catalyzed carbohydrate transport. Indeed, deletion of the presumed monocistronic lmo1095 had no effect on cellobiose consumption, but caused a general relief from carbon source-mediated virulence gene repression. Complementation of the mutant with the lmo1095 wild-type gene restored general virulence gene repression and we therefore called the encoded protein EIIBVir and the gene vgiB (virulence gene inhibitor B). EIIBVir becomes phosphorylated by PEP and the PTS components enzyme I, HPr and EIIACel2 at cystein-8. Complementation of the vgiB mutant with the Cys8Ala allele also restored general virulence gene repression, thus suggesting that it is the unphosphorylated form of EIIBVir, which inhibits the activity of PrfA.