Identification de cibles thérapeutiques pour sauvetage de protéines mutées par criblage fonctionnel à l'aide de la technologie CrispR/Cas9

par Sara Dias Henriques

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Isabelle Richard.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne) , en partenariat avec Approches génétiques intégrées et nouvelles thérapies pour les maladies rares (laboratoire) et de Université d'Évry-Val-d'Essonne (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2014 .


  • Résumé

    La pathogénicité de nombreuses maladies génétiques humaines est directement liée à la reconnaissance de protéines mal conformées par le contrôle qualité des protéines dans le réticulum endoplasmique (RE), conduisant à leur agrégation ou élimination. De façon intéressante, un certain nombre de ces protéines mutées ont néanmoins conservé leur activité biologique, suggérant qu'une amélioration de leur sortie du RE puisse réduire les signes pathologiques. L'étude des mécanismes précis de ce contrôle qualité, en plus de permettre une compréhension de la physiopathologie, peut donc ouvrir la porte vers des stratégies thérapeutiques pouvant traiter ces pathologies. Se posent néanmoins la question de toxicité potentielle de ces stratégies si elles ciblent des carrefours génériques de ce système tels que le protéasome. Il y a donc un grand intérêt à identifier l'ensemble des acteurs prenant en charge une protéine particulière afin de pouvoir développer des stratégies qui ciblent exclusivement les partenaires spécifiques de chacune des protéines prise en charge par ce système. Un tel mécanisme d'élimination des protéines mutées par le contrôle qualité du RE a été montré dans le cas de la mucoviscidose mais aussi dans un groupe de dystrophies musculaires appelées sarcoglycanopathies. Ces pathologies génétiques sont dues à des mutations dans les sarcoglycanes, glycoprotéines transmembranaires participant à la résistance des fibres musculaires aux contractions. Dans ce projet, nous nous proposons d'identifier les acteurs de la prise en charge des sarcoglycanes par le contrôle qualité du RE. Plutôt qu'une stratégie de type candidat, nous privilégions une stratégie systématique en tirant parti des outils récemment développés basés sur la technologie CrispR/cas9. Ce système a été initialement identifié en tant que système immunitaire adaptatif chez les bactéries et a été adapté en tant qu'outils d'édition génétique. Il est donc possible d'obtenir une inactivation de gène par coexpression d'un ARN guide (ARNg) ciblant la région d'intérêt et de la nuclease Cas9 qui va induire une cassure double brin qui sera réparée par NHEJ. Dans ce projet, nous utiliserons des librairies lentivirales exprimant des ARNg ciblant un ensemble de gènes humains (développés par les Drs Lander et Wang et disponibles sur Addgene) pour identifier dans un crible fonctionnel sur cellules humaines les protéines impliquées dans le contrôle qualité des sarcoglycanes. Nous construirons une lignée cellulaire exprimant stablement Cas9 et une protéine de fusion entre une sarcoglycane mutée et le récepteur MDR1. Ce récepteur permet la survie cellulaire en présence de drogues cytotoxiques. Cette fusion permettra un crible positif pour les cellules ayant perdu un gène participant à la rétention de la protéine mutée dans le RE. Inversement, nous réaliserons un crible sur des cellules exprimant une sarcoglycane normale en fusion avec la toxine diphtérique. Dans ce cas, la fusion permettra la sélection des cellules ayant reçu un ARNg ciblant un gène codant une protéine participant à la localisation des sarcoglycanes à la membrane. Les cellules résistantes des 2 cribles seront ensuite soumises à un séquençage haut débit pour identifier les ARNg sélectionnés. Une vérification individuelle sera effectuée ainsi qu'une étude du rôle précis des protéines dans le contrôle qualité. Ce travail devrait nous permettre d'identifier les partenaires du trafic des sarcoglycanes, de mieux comprendre les protéines qui dirigent le repliement, le trafic et la dégradation des glycoprotéines et donc d‘identifier des cibles potentielles pour une action thérapeutique pour les sarcoglycanopathies mais aussi potentiellement pour d'autres pathologies impliquant des glycoprotéines.

  • Titre traduit

    Identification of therapeutical targets for the rescue of misfolded proteins using a functional screen based on the CRISPR/Cas9 technology


  • Résumé

    The pathogenicity of many human genetic diseases is directly related to the recognition protein misshapen by the protein quality control in the endoplasmic reticulum (ER), leading to their aggregation or disposal. Interestingly, a number of these mutated proteins have nevertheless retained their activity biological, suggesting an improvement in output of RE can reduce pathological signs. The study of precise mechanisms of the quality control, in addition to providing an understanding of the pathophysiology, can therefore open the door to therapeutic strategies to treat these diseases. Nevertheless raise the question of potential toxicity of these strategies if targeted generic intersections of this system such as the proteasome. There is therefore a great interest in identifying all the players supporting a particular protein in order to develop strategies that target only specific partners of each of the support protein by this system. Such protein removal mechanism mutated by the ER quality control has been shown in the case of cystic fibrosis but also in a group of muscular dystrophies called sarcoglycanopathies. These pathologies are due to genetic mutations in the sarcoglycan, transmembrane glycoproteins involved in resistance to the contractions of the muscle fibers. In this project, we propose to identify the actors Support for sarcoglycans by the ER quality control. Rather than a candidate type of strategy, we favor a systematic strategy by leveraging newly developed technology-based tools CRISPR / cas9. This system was originally identified as the adaptive immune system in bacteria and was suitable as genetic editing tools. It is therefore possible to obtain a gene silencing by coexpression a guide RNA (gRNA) targeting the region of interest and cas9 nuclease which will induce a double-strand break, which will be repaired by NHEJ. In this project, we will use lentiviral libraries expressing gRNA targeting a set of human genes (developed by Lander and Dr. Wang and available on Addgene) to identify in a sieve functional in human cells the proteins involved in quality control of sarcoglycans. We will build a cell line stably expressing cas9 and a fusion protein between a mutated sarcoglycan and receiver MDR1. This receiver allows cell survival in the presence of cytotoxic drugs. This merger will allow a sieve positive for cells having lost a gene participating in the retention of the mutated protein into the ER. Conversely, we will take a screen on cells expressing normal sarcoglycan fused with diphtheria toxin. In this case, the fusion will allow for selection of cells that have received a gRNA targeting a gene encoding a protein involved in localization of the sarcoglycan to the membrane. Resistant cells of two screens will then be subjected to high-throughput sequencing to identify selected gRNA. An individual audit shall be performed and a study the role of specific proteins in quality control. This should allow us to identify partners traffic sarcoglycans, to better understand the proteins that direct the folding, trafficking and degradation of glycoproteins and thus to identify targets potential for a therapeutic action for sarcoglycanopathies but also potentially for other pathologies involving glycoproteins.