Etude de l'activité antivirale d'extraits d'Euphorbia de Corse : recherche de nouveaux diterpènes d'intérêt biologique

par Louis-Félix Nothias-Scaglia

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Jean Costa et de Marc Litaudon.

Thèses en préparation à Corte , dans le cadre de Université de Corse (1975-....). Ecole doctorale "Environnement et société" (ED 377) depuis le 15-09-2011 .


  • Résumé

    Le chikungunya est une maladie transmise par des moustiques du genre Aedes (dont A. albopictus, dit "moustique tigre"). Cette maladie provoque d'intenses fièvres et des douleurs articulaires chroniques fortement invalidantes. Les moustiques potentiellement vecteurs du virus du chikungunya (CHIKV) sont des espèces invasives qui, à la faveur du réchauffement climatique, se sont récemment implantés dans plusieurs régions du monde, dont la région méditerranéenne. Sa présence constitue un terreau favorable à la survenue d'épidémie. A l'heure actuelle, il n'existe ni vaccin, ni traitement médicamenteux efficace. Toutefois, des articles scientifiques ont récemment rapporté que des esters de diterpène isolés du genre Trigonostemon (Euphorbiaceae), avaient une activité inhibitrice de la réplication du CHIKV. Dans le cadre de ces travaux de thèse, des extraits de plantes du genre Euphorbia de Corse ont été étudiés dans le but d'isoler de nouvelles molécules douées d'activité antivirale sur la réplication du CHIKV. En collaboration avec le Dr. P. Leyssen (KU Leuven, Belgique), l'évaluation de l'activité anti-CHIKV de 45 extraits, obtenus à partir de 11 Euphorbiaceae de Corse, a permis de mettre en évidence la forte activité inhibitrice et sélective de des extraits d'espèces du genre Euphorbia in cellulo. L'activité antivirale d'une série de 27 diterpènes de type phorboïde, disponibles commercialement, a également été étudiée. Les résultats ont montré que certains dérivés avaient une forte activité inhibitrice de la réplication du CHIKV, mais aussi sur celle du virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Ces études ont permis d'une part, de déduire des relations structure-activité inédites et d'autre part, de soutenir l'hypothèse d'un mécanisme d'action anti-CHIKV impliquant la modulation des protéines kinases C (PKCs) par les phorboïdes. Dans le but de confirmer ou d'infirmer la présence des phorboïdes dans les extraits d'Euphorbia, une première méthode utilisant la chromatographie liquide (LC) haute performance couplée à un spectromètre de masse à trappe d'ions (MSn), a été développée à partir des composés standards. L'application de cette méthodologie a révélé qu'aucun des phorboïdes ciblés n'était présent dans les extraits d'Euphorbia. Ainsi, une seconde procédure LC-MSn a été mise en œuvre afin de détecter - de manière non ciblée - différents types d’esters diterpéniques. L'utilisation de cette approche a révélé que de nombreux diterpènes, non-apparentés aux phorboïdes, étaient présents dans les extraits. Un extrait de l'espèce Euphorbia amygdaloides subsp. semiperfoliata a été sélectionné pour réaliser un fractionnement bio-guidé, aboutissant à l'isolement et l'identification de 14 esters de jatrophane, dont neuf nouveaux composés. Parmi eux, l'un s'est avéré inhiber la réplication du CHIKV et du VIH. Par ailleurs, la structure d'un ester de jatrophane atypique, le jatrohémicétal, a été élucidée grâce à une approche originale combinant modélisation moléculaire et spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN). Enfin, une nouvelle procédure de purification ciblée par spectrométrie de masse tandem (MS/MS) en chromatographie en phase fluide supercritique (SFC) a été développée et appliquée sur des fractions bioactives d'E. amygdaloïdes subsp. semiperfoliata. L’interprétation des données MS/MS s’est appuyée sur la génération de réseaux moléculaires. Par cette méthodologie, quatre nouvelles molécules ont pu être détectées, purifiées et identifiées ; il s’agit de deux nouveaux esters de jatrophane et de quatre esters dérivés du 4-déoxyphorbol. L'activité anti-VIH des constituants isolés a également pu être explorée dans le cadre d’une collaboration avec l'équipe du Pr. Alcami (CNM, Espagne). Ainsi, l’un des esters de 4-deoxyphorbol s’est révélé être doué d'un exceptionnel pouvoir inhibiteur de la réplication du VIH-1 (IC50 = 8 nM et index de sélectivité > 6250). Son mécanisme d'action semble s'apparenter à celui de la prostratine (molécule antivirale de référence) mais avec des propriétés antivirales environ 28 fois supérieur. Un deuxième ester de 4-déoxyphorbol s’est avéré être un des plus puissants inhibiteurs du CHIKV isolé à ce jour (EC50 = 0,34 ± 0,12 µM and SI > 638).


  • Résumé

    Chikungunya fever is caused by an arthropod-borne virus that is associated with massive epidemics and severe morbidity (virus-induced arthralgia, fever, myalgia and rashes). Worldwide expansion of the mosquito vectors, such as Aedes albopictus ("Tiger moquito) is responsible for the spread of Chikungunya virus (CHIKV) throughout the world. A. albopictus has spread throughout Mediterranean areas, which could lead to epidemics outbreaks. Currently, no antiviral drugs or vaccines are available for the treatment or prevention of CHIKV infection. Since ten years, however, recent results showed that diterpene esters from Trignostemon (Euphorbiaceae) possess inhibiting activity of CHIKV replication. With the objective to discover new compounds with antiviral activities, 45 extracts from various plant parts of 11 Euphorbiaceae species native to Corsica were evaluated for selective inhibition of CHIKV replication. In collaboration with Dr. Leyssen (KU Leuven, Belgium), several extracts made from 10 Euphorbia species exhibited significant and selective anti-CHIKV activity in a virus-cell-based assay. The antiviral activities of 29 commercially available phorboïds were studied. Some phorboïds were potent inhibitors of CHIKV and human immunodeficiency virus (VIH) replication. Results allowed drawing new structure-activity relationships, which supported the hypothesis that PKC may be an important target in CHIKV replication. In order to confirm or infirm the presence of phorboïds with anti-CHIKV activity in Euphorbia extracts, a liquid chromatography (LC) coupled to linear ion trap mass spectrometry (MSn) method was developed using standard compounds. Application of this methodology indicated that none anti-CHIKV phorboïds was present in Euphorbia extracts. A second LC-MSn procedure was developed to profile untargeted phorboïdes. Results suggested that numerous other diterpene esters were present in the Euphorbia extracts. The species Euphorbia amygdaloides ssp. semiperfoliata was selected to perform a bioassay-guided purification procedure, which led to the isolation and identification of 14 jatrophane esters, including eight new components. Among them, antiviral evaluation indicated that one jatrophane ester was possessing anti-CHIKV and anti-HIV activities. Furthermore, the structure of an atypical jatrophane ester derivative, jatrohemiketal, was determined unambiguously through an original strategy combining NMR spectroscopy and molecular modeling. Finally, an original tandem mass spectrometry (MS/MS)-targeted supercritical fluid chromatography (SFC) method was developed and used to study bioactive fractions of E. amygdaloïdes ssp. semiperfoliata. The MS/MS data were analyzed by molecular networking. Thanks to this approach, four 4-deoxyphorbol esters and two new jatrophane esters were targeted, isolated and identified. Collaboration with the group of Pr. Alcami (CNM, Espagne) was started to explore the anti-HIV properties of the isolated diterpene esters. Thus, one compound derived from 4-deoxyphorbol esters proved to possess a potent inhibiting activity of HIV-1 replication (IC50 = 8 nM, and selectivity index > 6250). The investigation of the mechanism of this component indicated that it acted like prostratin, but with antiviral effect more than 28-fold. Furthermore, the evaluation of the anti-CHIKV activity indicated that another 4-deoxyphorbol derivative was one of the strongest inhibitor of CHIKV replication isolated up to date (EC50 = 0.34 ± 0.12 µM and selectivity index > 638).