Isolement et propriétés des cellules périneuronales de la moelle épinière

par Hussein Ghazale

Projet de thèse en Biologie Santé

Sous la direction de Jean-Philippe Hugnot et de Bernard Rothhut.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé , en partenariat avec INM - Institut des Neurosciences de Montpellier – Déficits Sensoriels et Moteurs (laboratoire) et de Plasticité du système nerveux central, cellules souches et tumeurs gliales. ( Equipe 4) (equipe de recherche) depuis le 01-11-2015 .


  • Résumé

    The state of the art on the topic of the project; Due to the complexity of the central nervous system (CNS), slight physiological changes can result in neurodegenerative diseases, most often which are irreversible, causing severe functional impairments. Several pathologies can arise from diseased neurons and oligodendrocytes such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Moreover, even a small insult to the CNS, such as spinal cord injury (SPI), also lead to permanent deficits. Whereas tremendous work has been done to unravel the molecular mechanisms responsible for these diseases and develop therapeutic strategies, many questions remained unanswered. How can we improve the survival of dying neurons? Can they be replaced? Can degenerating oligodendrocytes be replaced? Can deteriorating myelin be replenished? Can injured axons regenerate? An exciting possibility for therapeutic approach is the recruitment of endogenous cell populations present in the CNS that can provide support to, or even replace, injured and dying cells. These populations are heterogeneous, and include neural stem and progenitor cells which are disseminated in the parenchyma (mainly progenitors) or located in niches. Along this line, one CNS cell population which has been given little attention is the perineuronal cells (PC). These cells are closely apposed to the neuron somas and motoneurons are frequently surrounded by 2-3 of perineuronal cells. In the normal situation PC do not produce myelin although they appear to belong to the oligodendrocyte lineage although there are distinct from oligodendrocyte progenitors. PC can also display markers for immature neurons cells (Dcx). Their role are largely enigmatic. It has been suggested that PC may be involved in the remyelination process after injury and they could also have a role in protecting neurons against apoptosis by providing metabolically support. Recent findings shed a new interest in these cells, as their deficit has been observed in a variety of human mental disorders. The general interest of the project; The objective of my PhD project is to provide an in depth characterization of these perineuronal cells. Specifically, I aim to purify PC from the mouse adult spinal cord: -To explore their properties in vitro (proliferation, multipotentiality and plasticity) as well as the expression of receptors. - To explore whether these cells can closely interact with young motoneurons in vitro and whether they can influence their properties (survival, morphology, growth). - To explore their fate in vivo by grafting them into the brain of new born mice. 4- I will also characterize PC on adult human spinal cord sections hold in the lab. The scientific objectives; We know very little about the properties of PC. Their purification and the analysis of their properties in vitro and in vivo (graft) will provide answers on whether these cells 1-can survive in vitro, 2-can proliferate 3-are uni, bi or multipotential in vitro and in vivo 4-can modifiy motoneurons properties in vitro. 5- are similar in adult human spinal cord. The methodology; One major difficulty in exploring these PC further is the lack of good tools to purify them in order to study their properties in vitro and in vivo. Over the last years, Dr Hugnot's lab has identified a GFP transgenic mice as a very good tool to purify PC by FACS. After purification of PC by FACS, I will define cell culture conditions to assess their properties (proliferation, …). I will test whether PC can sustain a limited number of divisions or in contrast, whether they can proliferate extensively or even generate floating neurospheres. To guide me for these studies I will explore the range of receptors expressed by PC using receptors antibody arrays To explore their differentiation properties, I will treat PC with differentiating molecules such as BMP, T3/T4,… The possibility of generating neurons, astrocytes, oligodendrocytes, pericytes, Schwann cells will be explored by IF. To study their interactions with motoneurons, I will use fetal motoneurons purified by p75 sorting (routinely done in our institute). Using videomicroscopy, quantitative imaging and classical technics for apoptosis, I will measure the influence of PC on motoneurons. As for brain newborn grafts, the fate of transplanted PC (pre-labelled with CFP lentivirus) will be assessed after 1-2 months by IF against neuronal, CNS/PNS glial and pericytes markers. IF/IHC on human spinal cord sections (collaboration with neurosurgeons of the team) will be run classically. No major technical obstacles are foreseen for these tasks. Applications for human pathology and therapy This pioneer study should provide new data, both in man and rodents, on PC whose roles and properties are largely ill-defined. My objective is to explore several aspects of these cells to uncover some of their roles and assess whether they could have interesting properties for considering them as a potential cellular source to help spinal cord function recovery in ALS or SPI. These latter aspects will be addressed further with animal models these diseases.

  • Titre traduit

    Isolation and properties of spinal cord perineuronal cells


  • Résumé

    Etat de l'art En raison de la complexité du système nerveux, de légères modifications physiologiques peuvent entraîner des maladies neurodégénératives, le plus souvent irréversibles, provoquant de graves déficits fonctionnels. Ainsi la dégénérescence des motoneurones peut conduire à des pathologies telle la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Même des lésions restreintes de la moelle épinière (SPI), peuvent conduire à des déficits permanents. Bien que des progrès considérables aient été faits pour élucider les mécanismes moléculaires de ces pathologies, plusieurs questions restent ouvertes. Comment pouvons-nous améliorer la survie des neurones en souffrance? Peuvent-ils être remplacés? Les oligodendrocytes en dégénérescence peuvent-ils être remplacés? La détérioration de la myéline peut-elle être réparée ? Comment aider la repousse des axones abimés? Une possibilité fascinante serait d'utiliser des populations de cellules immatures endogènes, qui persistent chez l'adulte, pour régénérer le système nerveux. Ces populations sont hétérogènes et contiennent des cellules souches neurales situées notamment au niveau du canal central et des cellules progénitrices plutôt disséminées dans la substance blanche et grise. Les cellules perineuronales (PC) sont une population de cellules abondantes qui a été largement sous étudiée. Ces cellules sont étroitement associées au soma des neurones, notamment aux motoneurones. Dans la situation normale, les PC ne produisent pas de myéline, bien qu'elles appartiennent au lignage oligodendrocytaire. Elles sont cependant distinctes des progéniteurs d'oligodendrocytes. Les PC peuvent également exprimer des marqueurs de jeunes neurones (Dcx). Leur rôle physiologique reste largement énigmatique. Il a été suggéré qu'elles pourraient être impliquées dans les processus de remyélinisation après une lésion et elles pourraient aussi avoir un rôle dans la protection des neurones via un soutien métabolique. Un déficit de PC a été observé dans des troubles mentaux chez l'humain. Intérêt général L'objectif de mon projet de thèse est de caractériser en détails ces cellules perineuronales. Plus précisément, après les avoir purifiées de la moelle épinière de souris adulte, j'examinerai 1- leurs propriétés in vitro (prolifération, multipotentialité et plasticité) ainsi que l'expression de récepteurs. 2- si ces cellules peuvent interagir avec des jeunes motoneurones in vitro pour influencer leurs propriétés (survie, croissance). 3- leur comportement in vivo lorsqu'elles sont greffées dans le cerveau de souris nouveaux nés. 4-j'examinerai par ailleurs, les caractéristiques de PC humaines sur des sections de moelles épinières humaines via des collaborations avec des neurochirurgiens de l'équipe. Objectifs; Nous avons très peu de données sur les PC. Leur purification et l'analyse de leurs propriétés in vitro et in vivo (greffes) fourniront plusieurs réponses, à savoir : 1-si ces cellules peuvent survivre et proliférer in vitro, 2-sont multipotentes in vitro et in vivo. 3- peuvent modifier les propriétés des motoneurones in vitro. 4- sont similaires dans la moelle épinière adulte humaine. Méthodologie; Une difficulté majeure dans l'exploration des PC est le manque d'outils pour les purifier afin d'étudier leurs propriétés in vitro et in vivo. Le laboratoire du Dr Hugnot a identifié une souris transgénique GFP permettant de purifier les PC par FACS. Je chercherai des conditions de culture appropriées afin d'évaluer leurs propriétés in vitro notamment si elles ont un nombre limité de divisions ou au contraire, si elles peuvent proliférer extensivement ou même générer des neurosphères. Pour me guider pour ces études j'explorerai l'expression par les PC, de récepteurs pour les facteurs de croissance via un criblage de « receptor array ». Pour explorer leurs potentialités de différenciation, je traiterai les PC avec des composés tels que BMP, T3, ... La possibilité de générer des neurones, des astrocytes/ oligodendrocytes, des péricytes ou des cellules de Schwann sera exploré par IF. Pour étudier leurs interactions avec les motoneurones, j'utiliserai des motoneurones fœtales purifiés par tri p75 (préparés régulièrement dans notre institut). La vidéomicroscopie, l'imagerie quantitative et les techniques de détection de l'apoptose, me permettront de tester l'influence des PC sur les neurones. En ce qui concerne les greffes dans le cerveau de nouveau-nés, le comportement des PC transplantés (marquées CFP lentivirus) sera évalué après 1-2 mois par IF contre des marqueurs de différents lignages. Des IF /IHC sur des sections de la moelle épinière humaine seront réalisées pour caractériser les PC humaines. Aucun obstacle technique majeur n'est prévu pour ce projet Applications pour la pathologie humaine et de la thérapie Cette étude pionnière fournira des données nouvelles, à la fois chez l'homme et la souris, sur les cellules péineuronales dont les rôles et les propriétés sont peu étudiés. Mon objectif est d'explorer plusieurs aspects de ces cellules pour découvrir si elles pourraient avoir des propriétés intéressantes pour les considérer comme une source cellulaire potentielle afin d'aider à la réparation des lésions médullaires dans la SLA ou les SPI. Ces derniers aspects seront abordés dans le futur avec des modèles animaux de ces pathologies.