Cohésion des chromatides sœurs en réponse à un stress génotoxique

par Elise Vickridge

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Olivier Espeli.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    La réplication fidèle de l'ADN au cours du cycle cellulaire est essentielle au maintien de l'intégrité du génome à travers les générations. Toutefois, de nombreux éléments peuvent perturber et compromettre la réplication et donc cette intégrité. La mitomycine C (MMC) est une molécule génotoxique utilisée en chimiothérapie. Elle forme des liaisons covalentes entre les deux brins d'ADN ce qui est un obstacle à la bonne réplication de l'ADN. La rencontre de la fourche de réplication avec une liaison covalente entre les deux brins d'ADN va aboutir à une cassure double brin. Escherichia coli est un modèle d'étude très étendu car facile d'utilisation et simple. E coli possède divers mécanismes pour réparer ces lésions dont le régulon SOS. Le régulon SOS est un ensemble de gènes sous contrôle d'un promoteur réprimé par la protéine lexA. En réponse à des dommages à l'ADN, lexA est dégradé et les gènes du régulon sont activés. En utilisant une technique de biologie moléculaire qui permet de quantifier l'interaction entre deux chromatides sœurs restées cohésives derrière la fourche de réplication (appelé cohésion des chromatides sœurs), nous avons montré qu'en réponse à des cassures double brin générées par la MMC, la cohésion des chromatides sœurs augmente. Ce phénomène est dépendant de RecN, une protéine induite de façon précoce dans le régulon SOS. RecN est une protéine de type SMC (structural maintenance of chromosomes), un groupe de protéines impliqué dans la dynamique et la structure du chromosome. En parallèle, des techniques de microscopie confocale et de marquage du chromosome par des protéines fluorescentes ont permis de montrer que RecN est impliqué dans une condensation globale du nucléoide suite à un traitement MMC. Cette condensation du nucléoide s'accompagne d'un rapprochement des chromatides sœurs ségrégées. Ces deux phénomènes, médiés par RecN pourraient permettre une stabilisation globale des nucléoides et favoriser l'appariement des chromatides soeurs pour permettre la recombinaison homologue. Etonnement, l'inhibition de topoisomérases de type II (topoisomerase IV et gyrase) permettent de restaurer le phénotype d'un mutant recN en viabilité et en cohésion des chromatides sœurs. Les topoisomérases soulagent les liens topologiques générés par la réplication, la transcription etc.). Les liens topologiques non soulagés par les topoisomerases permettraient de garder les chromatides sœurs cohésives et favoriser la réparation, même en l'absence de RecN. De plus, une expérience de RNA seq (séquençage de tout le transcriptome de la bactérie) a révélé que dans un mutant recN, le régulon SOS est moins induit que dans les cellules sauvages. Ceci va de pair avec une déstructuration des foci de réparation RecA. On peut imaginer que le rapprochement des chromatides sœurs médié par RecN permettrait de stabiliser le filament RecA et donc l'induction du SOS.

  • Titre traduit

    sister chromatid cohesion in response to genotoxic stress


  • Résumé

    Maintaining genome integrity through replication is an essential process for the cell cycle. However, many factors can compromise this replication and thus the genome integrity. Mitomycin C is a genotoxic agent that creates a covalent link between the two DNA strands. When the replication fork encounters the DNA crosslink, it breaks and creates a DNA double strand break. Escherichia coli is a widely used model for studying complex DNA mechanisms. When facing a DNA DSB, E. coli activates the SOS pathway. The SOS pathway comprises over 50 genes that are under the control of a lexA repressed promoter. Upon a DSB induction, RecA, a central protein of the SOS response will trigger the degradation of lexA and all the SOS genes will be expressed. We have developed a novel molecular biology tool that reveals sister chromatids that are in very close contact. This process is called sister chromatid cohesion. It has been shown in the lab (Lesterlin et al. 2012) that during a regular cell cycle, the two newly replicated sister chromatids stay in close contact for 10 to 20 min before segregating to separate cell halves thatnks to the topoisomerase IV action. We have used this molecular biology tool to study sister chromatid cohesion upon a genotoxic stress created by MMC. We have shown that sister chromatid cohesion is maintained and prolonged when the cell is facing a DSB. Moreover, this sister chromatid cohesion is dependent on RecN, an SOS induced structural maintenance of chromosome-like protein. In the absence of RecN, the proximity between both sister chromatids is lost and this has a deleterious effect on cell viability. By tagging the chromosome with fluorescent proteins, we have revealed that RecN can also mediated a progressive regression of two previously segregated sister chromatids and this is coordinated with a whole nucleoid compaction. Further studies showed that this genome compaction is orderly and is not a random compaction linked to the action of cohesion. Interestingly, inhibiting topoIV in a recN mutant fully restores viability and sister chromatid cohesion suggesting that RecN's action is mainly structural and topological. On the other hand, inhibiting topoisomerase III in a recN mutant did not rescue the recN phenotype suggesting that topoisomerase III only acts on single strand gaps. An RNA-seq experiment in a wt and recN mutant revealed that the whole SOS is downregulated in a recN mutant. This suggests that RecN may have an effect on the SOS induction and thus RecA. This is in good agreement with the RecA-mcherry foci we visualized. In the wt strain, the RecAmcherry foci are defined and correspond to previously described work. However, in the recN mutant, these foci seem destructured. Altogether, these results show that RecN is an essential protein for sister chromatid cohesion upon a genotoxic stress. RecN binds to the DNA and keeps sister chromatids. Through a whole genome realignment, RecN mediates sister chromatid regression probably helping sister homology search.