Identification et caractérisation des boucles constitutives entre gènes et enhancers dans les cellules souches embryonnaires des souris.

par Charbel Souaid

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Daan Noordermeer.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Contexte : Au cours du développement, certains gènes sont activés ou réprimés de façon spatio-temporelle dans l'embryon. Dans les cellules souches de mammifères, une coopération entre de nombreux mécanismes de régulations épigénétiques permet de maintenir certains gènes dans un état transcriptionnel inactif particulier. En effet, ces gènes ainsi que leurs régions régulatrices (enhancers) sont associés à des domaines chromatiniens bivalents, enrichis à la fois avec des marques épigénétiques activatrices (H3K4me3) et répressives (H3K27me3). Ce mécanisme de régulation spécifique aux cellules souches permettrait « préparer » ces gènes pour une activation rapide et uniforme. Récemment, dans des embryons de drosophile, il a été découvert l'existence de grandes boucles constitutives entre certains gènes inactifs et leurs enhancers. Dans notre laboratoire, nous avons mis en évidence la présence de ces boucles dans des cellules souches mammifères au niveau de certaines régions du génome. A ce jour, la fonction de ces boucles constitutives entre gènes inactifs et enhancers reste largement inconnue. Notre projet consiste à identifier de manière systématique ces boucles constitutives dans les cellules souches mammifères et à caractériser leur(s) fonction(s) en analysant si ces dernières corrèlent avec les programmes d'activation des gènes lors de la différenciation. Méthodes : (1) Identification des boucles constitutives entre gènes et enhancers par la méthode HiC (Chromosome Conformation Capture à l'échèle génomique) et ChIP-seq dans des cellules souches des souris. Cette analyse HiC identifiera, à haute résolution, la présence des boucles entre gènes et enhancers ; et permettra de classifier, en utilisant des données de ChIP-seq, quelles boucles sont spécifiques des gènes transcriptionnellement inactifs (i.e. quelles sont les boucles constitutives). (2) Caractérisation fonctionnelle des boucles constitutives entre enhancers et gènes au niveau de deux régions d'intérêt (les gènes Dlx1 et Pax6). Dans ce but, des protéines régulatrices seront ciblée de façon ectopique aux promoteurs des gènes ou de leurs enhancers en utilisant le système hétérologue de levure UAS/Gal4. Des analyses épigénomiques et transcriptomiques (études des modifications des histones par ChIP-qPCR ou ChIP-seq, modifications tridimensionnelles (4C-seq) et changements des activités transcriptionelles (RT-qPCR) permettront de mesurer l'impact du ciblage ectopique de ces protéines régulatrices sur ces régions. Résultats attendus : Les résultats générés par ce projet de thèse permettront de mieux comprendre le rôle fonctionnel des boucles constitutives entre enhancers et gènes réprimés dans les cellules souches de mammifères. Notamment, notre approche fonctionnelle, permettra de vérifier l'hypothèse que ces boucles constitutives « préparent » les gènes inactifs pour une activation ultérieure rapide et robuste. Ces études nous aideront à mieux comprendre les mécanismes qui « préparent » les cellules souches pour le développement embryonnaire en impliquant les fonctions des enhancers, l'épigénétique et l'organisation tridimensionnelle du génome.

  • Titre traduit

    Identification and characterization of constitutive gene – enhancer loops in mouse embryonic stem cells


  • Résumé

    Embryonic development requires reliable and precise activation and silencing of regulatory genes at different times and places in the embryo. To achieve these complex patterns of activation and silencing, many unique regulatory mechanisms act together: • Regulators of embryonic development can be silenced by Polycomb complexes, the H3K27me3 histone mark and 3D compartmentalization of chromatin (Boyer et al, Noordermeer et al). • Regulators of embryonic development can be activated by forming chromatin loops with nearby enhancers that specify when and where in the embryo the gene is expressed. • Promoters and enhancers of regulators of embryonic development are kept inactive, yet responsive, by bivalent (both repressing H3K27me3 and activating H3K4me3) histone marks (Bernstein et al, Rada-Iglesias et al) that can provide a rapid and uniform activation when activity is required in the embryo. Intriguingly, recent insights from Drosophila indicate that inactive regulators of embryonic development form gene – enhancer loops prior to their activation (Ghavi-Helm et al). We observe similar loops in mouse embryonic stem cells as well. We speculate that these constitutive gene – enhancer loops provide improved reliability and reactivity to the activation and silencing of regulators of embryonic development. Understanding the function of constitutive gene – enhancer loops therefore will help us to link enhancer function, epigenetics (particularly Polycomb repression) and 3D chromatin looping together. In this project, we will identify constitutive gene – enhancer loops on a genome-wide scale in mouse stem cells using a combination of HiC, 4C-seq and ChIP-seq. Moreover, we will dissect the function of constitutive gene – enhancer loops at the inactive Dlx1 and Pax6 genes, two well-known regulators of embryonic development, by targeting regulatory proteins to their promoters or enhancers and quantify the effect on transcriptional activity (RT-qPCR), epigenetic status (ChIP) and 3D genome organization (4C-seq).