Médecine régénérative cutanée, aspects fondamentaux et concepts d'applications en thérapie cellulaire : contrôle du statut de cellule souche dans l'épiderme humain et facteurs de transcription liés au réseau de signalisation du TGF-B1.

par Julien Coutier

Projet de thèse en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Michèle Martin et de Nicolas Fortunel.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Cancérologie : biologie - médecine - santé , en partenariat avec Laboratoire de Génomique et Radiobiologie de la Kératinopoïèse (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-11-2015 .


  • Résumé

    La médecine régénérative basée sur une utilisation de cellules souches adultes est une réalité clinique pour la moelle osseuse, la cornée et la peau. La préparation de greffons cutanés nécessite une phase d'amplification ex vivo des cellules du donneur, pendant laquelle le maintien des caractéristiques des cellules souches demeure un paramètre très critique. La préservation du potentiel régénératif des cellules souches au sein des greffons de peau reconstruite conditionne en effet le succès d'une prise de greffe à long terme. Ainsi, parvenir à maintenir l'état d'immaturité de ces cellules et à contrôler leur prolifération constitue un enjeu clé de la biologie des cellules souche de l'épiderme humain. Dans ce contexte, notre laboratoire étudie la voie de signalisation du TGF-B, car elle comporte des candidats majeurs de la maîtrise de ces processus. Les travaux des scientifiques de l'équipe ont notamment contribué à documenter la pléiotropie du rôle de l'isoforme TGF-B1 dans le contrôle de l'homéostasie des progéniteurs et cellules souches tissulaires humains. Néanmoins, l'action spécifique de ce facteur sur le compartiment des cellules souches kératinocytaires (CSK), ainsi que les mécanismes de régulation associés, restent très partiellement documentés. Ce projet de thèse portera sur l'étude de facteurs de transcription (FTs) en aval de la signalisation du TGF-B1, non connus pour intervenir dans la biologie des CSKs, mais identifiés au laboratoire comme candidats originaux. Le modèle de travail utilisé sera celui des 'holoclones' qui correspondent à la descendance clonale de kératinocytes de statut 'souche'. L'approche reposera sur l'analyse de l'impact de perturbations génétiques ciblant ces FTs sur la fonctionnalité des holoclones. Pour ce faire, nous utiliserons d'une part des vecteurs lentiviraux codant soit pour un shARN dirigé contre l'ARNm d'un FT (répression), soit pour son ADNc (surexpression). Nous mettrons d'autre part en oeuvre la technologie CrispR/Cas9 afin d'obtenir un contexte d'invalidation d'un seul ou des deux allèles du gène étudié. Nous étudierons de manière comparative des holoclones génétiquement modifiés, présentant les caractéristiques [FTwt], [FTnul], [FTfaible] et [FTfort]. Ces recherches intégreront deux niveaux d'investigation : 1) un niveau fonctionnel, visant à identifier les potentialités des holoclones contrôlées par les FTs étudies (cycle cellulaire, clonogénicité, croissance à long terme, organogénèse 3D, xenogreffe chez la souris Nude); 2) un niveau moléculaire, visant à décrypter les réseaux de signalisation impliqués dans la réponse des holoclones à ces FTs (profils transcriptionnels et épigénétique, cartographie des séquences génomiques cibles par une approche de ChIP-seq). Caractériser le rôle de nouveaux régulateurs de la fonctionnalité des CSKs humaines constituera un apport significatif sur le plan fondamental, et pourra conduire à l'identification de cibles originales pour des approches de régénération et cicatrisation cutanée. L'identification de nouvelles cibles capables de contrôler le potentiel des CSKs permettra d'explorer leur utilisation dans le contexte de la bio-ingénierie des greffons cutanés destinés au traitement de la brûlure thermique et radio-induite, en partenariat avec un centre de thérapie cellulaire (Coll. CEA-Hopital Percy)

  • Titre traduit

    Cutaneous regenerative medicine, fundamental aspects and concepts for applications in cell therapy : control of the stem cell status in human epidermis and transcription factors of the TGF-B1 signaling network.


  • Résumé

    Regenerative medicine based on the use of adult stem cells is a clinical reality for bone marrow, cornea and skin. The preparation of bio-engineered cutaneous grafts requires a phase of ex vivo expansion of cells from the donor, during which the maintenance of stem cell characteristics is a critical parameter. Indeed, the preservation of stem cell regenerative potential within reconstructed skin grafts is necessary for obtaining successful long-term grafting. Thus, controlling the immature status of these cells and controlling their proliferation is a very important issue in the field of human epidermal stem cell biology. In this context, our laboratory is studying TGF-B signaling, as this pathway involves major candidates regulating these processes. Studies performed by scientists of the team have documented the pleiotropic effect of TGF-B1 isoform in the control of human tissue stem and progenitor cells. However, the specific effects of this growth factor on the keratinocyte stem cell compartment (KSCs), as well as the associated regulatory mechanisms, are still partially know. Through this thesis project, we will investigate the function of transcription factors (TFs) related to TGF-B1 signaling, with unknown functions in KSCs, but identified by the team as relevant candidates. The work will be conducted using the working model of 'holoclones', which corresponds to the clonal progeny of keratinocytes corresponding to a ‘stemness' status. The approach will be based on the analysis of the impact of a genetic perturbation targeting these TFs on the functionality of holoclones. For this purpose, we will use lentiviral vectors encoding specific shRNAs (repression) or the corresponding cDNA (overexpression). In addition, we will use the CrispR/Cas9technology to obtain invalidation of one or both the alleles of the studied gene. We will perform a comparative study of genetically modified holoclones, presenting the [TFwt], [TFnul], [TFlow] and [TFhigh]. These researches will integrate two levels of investigation: 1) a functional level, which objective us identification of holoclones potentialities under the control of TFs (cell cycle, clonogenicity, long-term growth, 3D organogenesis, xenograft onto Nude mice); 2) a molecular level, which aims at characterizing the regulatory networks responsible for holoclones cellular responses to TFs (transcriptional and epigenetic profiling, mapping of genomic target by ChIP-seq). Characterizing the role of new regulators of the functionality of human CSKs will bring significant advances at the fundamental research level, and may lead to the identification of original targets suitable for cutaneous regenerative and wound-healing approaches. The perspective arising from the use of a target identified to control the potential of CSKs will be explored in the context of skin graft bio-engineering for the treatment of thermal and radiation-induced burns, in partnership with a cell therapy center (Coll. CEA-Percy Hospital)