Aryl hydroacarbon receptor (AHR) dans la LMC

par Mélanie Gentil (Daboux)

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Ali Turhan.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé (Villejuif, Val-de-Marne) , en partenariat avec Inserm U 935 - Modèles de cellules souches malignes et thérapeutiques (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 02-11-2012 .


  • Résumé

    AhR est un facteur de transcription ubiquitaire de la famille des protéines bHLH-PAS (basic-Helix-Loop-Helix/PER-ARNT-SIM), qui intervient dans la division cellulaire, la quiescence et les réponses inflammatoires. Après sa liaison avec un ligand, AhR, qui est associé à HSP60 dans le cytoplasme se dissocie et se transloque dans le noyau où il se lie à l'aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT), c'est ce complexe dimérique qui permet l'activation de la transcription. Il a été démontré qu'AhR est impliqué dans l'hématopoïèse normale notamment dans la prolifération des progéniteurs. De plus, les souris K/O pour AhR ont un phénotype ressemblant un syndrome myéloprolifératif, suggérant qu'AhR pourrait jouer un rôle dans la quiescence des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Le but de notre étude est d'évaluer le rôle d'AhR et de ses partenaires dans les progéniteurs et les cellules souches de LMC. Nous avons d'abord évalué l'expression d'AhR dans la lignée UT7 et la lignée UT7 exprimant BCR-ABL. L'expression d'Ahr était moins importante dans la lignée exprimant AhR comparé à la lignée contrôle. Le transcrit Ahr a été ensuite quantifier dans les cellules mononuclées du sang au moment du diagnostic de LMC chez 31 patients. Nous avons trouvé une diminution significative comparé à une population contrôle (n=15) (p<0.05). Huit patients ont été testés au moment du diagnostic et à la rémission moléculaire majeure et l'expression d'Ahr a retrouvé le niveau des contrôles. Pour déterminer s'il existe un différentiel d'expression d'AhR entre les CSH et les progéniteurs, nous avons analysé l'expression d'AhR dans des cellules CD34+ (n=11) ainsi que sur des cellules CD34+38- (n=3). Son expression est réduite dans les cellules 34+ mais pas des cellules plus primitives en comparaison avec les contrôles. Ces données suggèrent que la voie de signalisation d'AhR pourrait être une cible pharmacologique. Nous avons d'abord évalué les effets potentiels de Stem Regenin1 (SR1), qui est un antagoniste d'AhR et qui permet d'augmenter le nombre de progéniteurs leucémiques de leucémie aigué et les cellules souches normales. Les cellules CD34+ de LMC traitées par du SR1 voient leur expression de AHRR (répresseur d'AhR) être diminués prouvant l'effet de SR1. Après 7 jours de culture liquide, SR1 (0.75µM) induit une expansion massive de cellules leucémiques (60 fois plus) comparé aux conditions contrôles (p<0.05). De même, SR1 permet l'expansion de 6 fois du nombre de cellules leucémiques CD34+ (p<0.05) par rapport aux conditions contrôles. Par la suite, des tests de progéniteurs de de cultures à long terme avec des cellules traitées par SR1 ont été menés, afin de déterminer si SR1 permettant le maintien et/ ou l'expansion des progéniteurs et des cellules souches. Les cellules CD34+ de LMC sont mis en culture avec SR1 pendant 7 et 14 jours et nous observons une expansion de 3 fois du nombre de CFC (p<0.05). De même des cultures à long terme (LTC IC) ont été effectuées après que des CD34+ de LMC ont été mis en culture 4 et 7 jours avec du SR1 et le nombre de progéniteurs dérivés des LTC-IC a été multiplié par 10. Par la suite, nous avons utilisé un agoniste naturel d'AhR le 6-formyllindolo (3,2-b) carbazole (FICZ). Son effet a été validé par une augmentation de l'expression d'un gène cible d'AhR, CYP1A1 chez les cellules CD34+ de LMC mis en culture pendant 7 jours. En culture en milieu liquide, après 7 jours, le nombre de cellules CD34+ est diminué de moitié par rapport aux conditions contrôles pour une concentration de FICZ de 100nM. Après 4 jours de culture avec FICZ, et en association avec l'imatinib ou le dasatinib, le nombre de progéniteurs diminue de façon significative (p<0.05). De même, après 3 jours de culture liquide suivie d'un test de culture à long terme, le nombre de progéniteurs issus des LTC-IC est diminué par rapport aux conditions contrôles. En conclusion, nous avons tout d'abord démontré que l'expression d'AhR était down régulé dans la LMC. Son inhibition permet l'expansion massive de progéniteurs et de cellules souches leucémiques et à contrario les agonistes d'AhR inhibe le développement des CFCs et des LTC-IC. Cette voie de signalisation d'AhR pourrait donc être une potentielle cible thérpeutique

  • Titre traduit

    Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) Pathway in Chronic Myeloid Leukemia


  • Résumé

    AhR is an ubiquitous basic helix-loop-helix protein, mediating cell responses to external ligands and involved in cell division, cell quiescence and inflammatory responses. After ligand binding, AhR, which is an intracytoplasmic receptor associated to HSP60, dissociates from it and translocates to nucleus where it binds to aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT), this dimeric complex activating transcription. It has been shown that AhR is involved in normal hematopoietic progenitor proliferation in human cells. In addition, AhR K/O mice exhibit a myeloproliferative syndrome-like disease, suggesting a role of AhR in hematopoietic stem cell (HSC) quiescence. The goal of this study was to study the potential role of AhR and its partners in CML progenitors and stem cells. We have first evaluated the expression of AhR in UT7 cell line and UT7-cells expressing BCR-ABL. AhR expression was highly reduced in UT7 cell expressing BCR-ABL as compared to control. AhR transcript was then quantified in primary peripheral blood CML cells at diagnosis (n= 31 patients) and were found to be very significantly reduced as compared to normal controls (n=15) (p < 0.05). In 8 of these patients, AhR mRNA was quantified during TKI-induced major molecular response (MMR) and were found to increase towards levels found in controls. To determine if AhR expression is differentially expressed in HSC as compared to progenitors, we have analyzed AhR expression in CD34+ cells (n=11) as well as in highly purified CD34+ CD38- cell populations (n= 3). Interestingly, AhR expression was reduced in leukemic CD34+ progenitors (n= 11) but not in more primitive leukemic CD34+ CD38- cells (n= 3) as compared to normal controls (n= 15). These data suggested that AhR, known to be involved in HSC quiescence, could be amenable to pharmacological manipulation in CML cells. We first evaluated the potential effects of StemRegenin (SR1), which is an AhR antagonist on the growth of leukemic progenitors and stem cells. CD34+ CML cells treated with SR-1 had a reduced expression of AHHR, a repressor of AhR. In 7-day liquid cultures, the use of SR-1 at 0.75 µM induced a major expansion of leukemic cells by 60-fold as compared to conditions without SR-1 (p < 0.05). Similarly, SR-1 allowed expansion of leukemic CD34+ cells by 6-fold in 7 days, as compared to controls. CD34+ cells expanded in SR-1, were then used in CFC and LTC-IC assays to determine if SR-1 could allow maintenance and/or expansion of CML progenitors and stem cells. CML CD34+ cells cultured with SR-1 for 7 and 14 days exhibited a massive expansion of leukemic CFC (> 3 fold increase). Similarly, CD34+ cells expanded with SR-1 for 4 and 7 days followed by long-term culture initiating cells (LTC-IC) assays, revealed a massive expansion ( > 10-Fold) of LTC-IC-derived progenitors. We then used the 6-Formylindolo (3,2-b) carbazole (FICZ), a natural agonist of AhR, to determine its effects on leukemic progenitors and stem cells. The agonistic effect of FICZ was validated by the increase of the downstream target of AHR CYP1A1 transcripts after 7 days of culture. As expected, liquid culture of CML CD34+ cells induced a 2-fold decrease of CD34+ cells at day+7 in the presence of 100 nM of FICZ. Day-4 FICZ cultured CD34+ cells showed a significant reduction of leukemic CFC potential with a synergistic profile with Imatinib and Dasatinib ( p < 0.05). Similarly, in three patients, in LTC-IC assays started after 3-day FICZ-treated cells, 5-week LTC-IC-derived progenitors showed a significant growth inhibition with a synergistic profile with Imatinib. In conclusion, these findings demonstrate for the first time that down-regulation of AhR expression, a major cell cycle regulator, is involved in the MPD phenotype associated with CML. The further inhibition of AhR expression by its antagonist allowed massive expansion of hematopoietic progenitors and stem cells. In contrast, AhR agonists inhibit clonogenic and LTC-IC-derived stem cell growth and could be used in LSC targeting in CML.