Développement de peptides inhibiteurs du domaine PDZ de CAL pour le traitement de la mucoviscidose.

par Quentin Seisel

Projet de thèse en Biologie Santé

Sous la direction de Prisca Boisguerin.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé , en partenariat avec CRBM - Centre de Recherche en Biologie cellulaire de Montpellier (laboratoire) depuis le 01-01-2015 .


  • Résumé

    La mucoviscidose ou fibrose kystique (FK) est une maladie génétique causée par des mutations de l'allèle ΔF508 codant la protéine « cystic fibrosis transmembrane conductance regulator » (CFTR). Cette protéine est un canal ionique transmembranaire perméable au chlore dont le dysfonctionnement entraine un déséquilibre osmotique entre le milieu extracellulaire et intracellulaire, conduisant à l'accumulation de mucus dans différents tissus épithéliaux. Dans le poumon, l'insuffisance de la clairance mucociliaire conduit à la mise en place de biofilms bactériens résistants aux médicaments. A l'heure actuelle il n'existe pas de traitements antibiotiques efficaces face aux différentes souches bactériennes devenues multi-résistantes. L'inflammation liée à aux infections pulmonaires chroniques est actuellement la principale cause de morbidité et de mortalité de la FK. La durée de vie des patients est généralement inférieure à 40 ans. Environ 90% des patients atteints de mucoviscidose portent une ou deux copies de l'allèle ΔF508. Cette mutation (ΔF508) provoque un mauvais repliement de la protéine CFTR qui est alors rapidement dégradée ou présente une activité très réduite. Différentes molécules thérapeutiques ont été mises au point pour corriger le défaut de repliement de CFTR, mais aucune molécule ne semble pour le moment être efficace en tant que monothérapie. Néanmoins, en combinaison, certaines molécules produisent une amélioration significative (25%) de la fonction pulmonaire chez les patients homozygotes ΔF508. Pour cibler davantage de patients et augmenter la réponse fonctionnelle de ces molécules thérapeutiques, nous proposons notre stratégie thérapeutique translationelle originale, consistant à empêcher la dégradation du canal ΔF508-CFTR. Aucun essai clinique n'inclue de composé spécialement conçu pour augmenter la stabilité de la protéine CFTR à la membrane apicale. Après avoir identifié le ligand intracellulaire de la protéine CFTR (CAL, pour « CFTR-Associated Ligand ») comme médiateur clé de sa dégradation, nous avons conçu des peptides d'interface bloquants cette liaison critique : CFTR-CAL. Nous avons montré que ces peptides agissent comme premiers « stabilisateurs » de ΔF508-CFTR dans les cellules épithéliales bronchiques dérivées de patients atteints de FK. Les avancées précliniques de nos inhibiteurs de CAL (iCAl) sont cependant encore limitées par leurs faible affinités, leur mauvaise délivrance cellulaire et par des données limitées sur leur efficacité en tant que traitement de point. Ce projet sera effectué en collaboration avec le Dr D. R. Madden (Geisel School of Medecine- Etats-Unis) et avec le Dr. R. Volkmer et Dr. N. Derichs (Charité de Berlin, Allemagne) à l'aide d'un financement NIH. La thèse proposée est axée sur l'optimisation des peptides iCAL et sur le développement d'une vectorisation fonctionnelle à l'aide de peptides vecteurs. L'étudiant(e) recruté(e) sera amené(e) à améliorer l'inhibiteur iCAL en introduisant dans la séquence des acides aminés non naturels en utilisant la technologie de la synthèse SPOT. Les nouvelles molécules iCAL développées seront sélectionnées en fonction de leur résistance aux protéases et de leur affinité pour la protéine CAL (protéine fournie par le laboratoire du Dr Madden). La deuxième partie de la thèse portera sur la vectorisation des peptides d'intérêt afin d'augmenter leur internalisation cellulaire et leurs effets biologiques. Différents peptides vecteurs sont disponibles dans notre laboratoire. Ils seront criblés pour identifier le meilleur candidat pour internaliser les molécules dans les cellules épithéliales polarisées. De plus, l'étudiant(e) recruté(e) étudiera par microscopie de fluorescence (grâce à la plateforme d'imagerie du CRBM) le devenir des molécules iCAL vectorisées in cellulo. Dans la troisième année, l'étudiant(e) recruté(e) pourra passer quelques mois dans le laboratoire de Dr D. R. Madden (si une bourse de voyage supplémentaire est obtenue) afin d'analyser les nouvelles molécules iCAL dans un système de cellules primaires pulmonaires issues de patients FK.

  • Titre traduit

    Development of CAL PDZ inhibiting peptides for the treatment of cystic fibrosis.


  • Résumé

    The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is an ion channel that is mutated in patients with cystic fibrosis (CF), disrupting fluid and ion balance in multiple epithelial tissues. In the lung, failure of mucociliary clearance facilitates the establishment of drug-resistant bacterial biofilms, despite advanced antibiotic and pulmonary clearance strategies. As a result, chronic lung infection and inflammation are currently the major causes of CF morbidity and mortality, limiting lifespan to <40 years. ~90% of CF patients carry one or two copies of the F508 allele, which encodes a protein that is inefficiently folded, shows limited channel activity, and is rapidly degraded. Compounds have been identified that address the folding and channel defects. Neither provides significant benefit as a monotherapy, but in combination they produce significant improvement in lung function in 25% of F508 homozygous patients. To reach more patients and increase the functional response, we propose the early-stage pharmacological validation of a novel translational strategy to address the remaining defect – the breakdown of rescued F508-CFTR. No clinical trials include compounds specifically designed to increase CFTR stability at the apical membrane. Having identified the CFTR-Associated Ligand (CAL) as a key mediator of CFTR degradation, we have localized a critical binding interface, designed peptides that block it, and shown that they act as first-in-class ‘stabilizers' of functional F508-CFTR in polarized CF bronchial epithelial cells. Preclinical advancement of our inhibitor-of-CAL (iCAL) approach is currently limited by lead affinity, delivery, and limited data on the extent of rescue in state-of-the-art combination therapy. This project in collaboration with Dr. D.R Madden (Geisel School of Medicine – US) and with Dr. R. Volkmer and Dr. N. Derichs (Charité Berlin, DE) is founded by the NIH. The proposed PhD thesis will focused on the optimization of the iCAL peptide and on the development of functional vectorization of the molecule using “cell penetrating peptides”. The recruited PhD student will improved the iCAL inhibitor by introducing in the sequence non-natural amino acids using the SPOT synthesis technology. The new developed iCAL molecules will be selected due to their protease resistance and to their affinity to the CAL PDZ domain (protein will be kindly provided by Dr. D.R. Madden). The second part of the PhD work will deal with the vectorization of the peptide to increase its cellular internalization and in terms to increase its biological effect. Different “cell penetrating peptides” are available in our laboratory, which will be screen to identify the optimal one for a delivery in polarized epithelial cells. Moreover, the recruited PhD student will used fluorescence microscopy (platform available at CRBM) to study the cellular localization of vectorized iCAL molecules in co-incubation with a diversity of endocytosis inhibitors or with specific cellular markers. In the third year, the PhD student could spend some months in the laboratory of Dr. D.R. Madden (if additional travel grants could be applied) to analyze the new iCAL stabilizators in human primary pulmonary cells from CF patients.