Immunociblage de la voie MAPK p38 par l'utilisation d'intracorps

par Emilie Renaud

Projet de thèse en Biologie Santé

Sous la direction de Christian Larroque et de Laurence Guglielmi.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé , en partenariat avec IRCM - Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier (laboratoire) et de Criblage fonctionnel et criblage du cancer. (equipe de recherche) depuis le 01-01-2016 .


  • Résumé

    L'implication de la voie MAPK p38 a été démontrée dans la réponse des cellules d'adénocarcinomes coliques humaines à l'Irinotécan ainsi que dans des échantillons cliniques de tumeur colorectale de patients traités par FOLFIRI. En effet la forte activation par phosphorylation de la p38 est corrélée à la résistance des cellules et au statut non répondeur des patients à l'Irinotécan. Plus précisément, les isoformes p38alpha et p38beta sont fortement activées par phosphorylation dans des lignées cellulaires résistantes à l'Irinotécan, alors que leur inhibition restaure l'activité cytotoxique de la drogue. Nous souhaitons développer des outils ciblant de manière hautement sélective la p38alpha et la p38beta, ainsi que leur phosphorylation respective, afin d'évaluer finement la contribution de chacune des deux isoformes dans la résistance au traitement. Nous avons ainsi développé des intracorps, qui sont des fragements d'anticorps exprimés de façon ectopique dans les cellules sous format scFv. Ces intracorps combinent des spécificités et affinités de liaison élevées à l'antigène et sont capables d'intéragir spécifiquement avec des domaines ou motifs spécialisés de protéine. Afin de détecter la phosphorylation de chacune des MAPK p38alpha et p38beta endogène, nous cherchons à sélectionner un couple de scFv pour chaque isoforme : l'un reconnaissant la p38, l'autre spécifique de la forme active phosphorylée de la protéine. L'expression de ce couple de scFv en tant qu'intracorps, fusionnés à des protéines fluorescentes dans des lignées cellulaires humaines de cancer colorectal, permettra d'étudier la dynamique d'activation de chacune des ces MAPK endogène par FLIM-FRET et ainsi de comparer les changements spatiaux et temporels du signal p38 entre des lignées résistantes et sensibles à l'Irinotécan. Ces anticorps nous aideront à mieux comprendre l'implication des voies p38 dans la résistance aux traitements et comment chacune de ces voies est activée au sein de la cellule vivante. Enfin, l'action de divers inhibiteurs sur la régulation de la voie MAPK sera testé, et nous permettra éventuellement d'identifier de nouveaux inhibiteurs chimiques avec une meilleure spécificité que ceux actuellement disponibles.

  • Titre traduit

    Immunotargeting of p38 MAPK pathway by the use of intrabodies


  • Résumé

    We recently demonstrated that MAPK p38 pathway is involved in Irinotecan sensitivity in human colorectal adenocarcinoma cell lines, and that MAPK p38 phosphorylation correlates with resistance to Irinotecan-based treatment in clinical samples of metastatic colorectal tumor. More precisely, in resistant cell lines, p38alpha and p38beta isoforms show a high phosphorylation level, and sensitivity of the cells can be restored by pharmacological inhibition of the p38 MAPKs. However, current tools used to study the MAPK p38 pathway have several limitations: pharmacological inhibitors are not specific to a single p38 isoform and are hampered by off-target effects; the use of down (RNAi) or up-regulation of wild-type or mutant MAPK gives biased information on the endogenous protein; the measure of the p38 activity by following target activation lacks specificity owing the intermingling of cellular pathways. The aim of our project is to develop new tools to specifically detect the phosphorylation of each of the MAPK p38alpha and p38beta isoform in living cells. These tools will be then used to study the dynamics and the localization of p38 activation in human colorectal adenocarcinoma cell lines resistant and sensitive to Irinotecan. The approach will develop and use intrabodies, which are small recombinant antibody fragments (scFv format) expressed in cells, to target MAPK p38alpha and p38beta and their active forms. As MAPK p38 are soluble and spread evenly in cells we will use a pair of scFv, one recognizing the protein and the other the phosphorylated form of each MAPK p38alpha and p38beta. Expression of this scFv as intrabodies fused with fluorophores in human cell lines will permit to study the activation of each endogenous p38 by FLIM-FRET in a spatial and temporal way. Such antibodies will help to better understand the involvement of each p38 in the drug resistance and how p38 MAPK is activated within the live cell. Finally, we will characterize the action of various inhibitors on the MAPK pathway regulation, and eventually identify new chemical inhibitors with a better specificity than the currently available ones.