Simulations numériques des transferts d'électrons dans les flavohémoglobines

par Xiaojing Wu

Projet de thèse en Chimie

Sous la direction de Aurélien De la lande.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Sciences Chimiques : Molécules, Matériaux, Instrumentation et Biosystèmes , en partenariat avec Laboratoire de Chimie Physique (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Les transferts d'électrons (TE) sont des processus physico-chimiques fondamentaux ayant une importance majeure en chimie, en biochimie, en électronique ou en science des matériaux. En biologie les TEs sont à la base de processus tels que la photosynthèse, la respiration cellulaire, la catalyse enzymatique ou la lutte contre le stress oxydatif.[1] L'un des objectifs des recherches portant sur les TE en biologie est de comprendre comment sont contrôlés le sens (thermodynamique) et la vitesse (cinétique) des transferts au sein des biomolécules. Il est important de noter que du fait de la forte inhomogénéité des biomolécules (protéines, ADN, …) et de leurs anisotropies, les lois physico-chimiques gouvernant les TE dans les protéines sont a priori différentes de celles régissant les TE en solution homogènes, justifiant donc que l'on s'y intéresse. Le système d'étude de cette thèse sera la famille des flavohémoglobines. Ces protéines sont exprimées par des organismes tels que les bactéries, les levures ou les champignons avec comme fonction principale une activité d'oxyde nitrique dioxygénase (NO+O2+1e- NO3-).[2] Cette fonction permet à ces microorganismes de se défendre contre les composés réactifs de l'azote lesquels sont produits par les systèmes immunitaires des organismes pluricellulaires lorsque les microorganismes tentent de les envahir. Pour cette raison les FHB sont des cibles prometteuses pour le développement de nouveaux antibiotiques.[3] Le mécanisme chimique de la FHB est largement inconnu. Il est cependant accepté que la réaction de dioxygénation a lieu sur un groupe hémique contenu dans le domaine globine de la FHB. L'ordre de coordination de NO et/ou de O2 sur le cation Fe est toujours débattue.[2] O2 ne se fixe sur Fe que dans sa forme ferreuse, tandis que NO peut se fixer sur la forme ferreuse ou ferrique. La poche hydrophobe se situant sous l'hème accueille en outre un lipide qui pouffait être lié au fer au niveau de l'une des instaurations C=C des chaines aliphatiques. Dans ce cas la coordination de O2 ou NO nécessiterait de déplacer le lipide. La réaction de dioxygénation nécessite l'apport d'un électron par une flavine ancrée dans un autre domaine protéique. La distance hème-flavine est d'environ 12 Å. Le domaine flavine joue donc le rôle d'injecteur d'électron au domaine globine. L'objectif de cette thèse est de mieux comprendre les liens existant entre TE flavine-hème et coordination de ligands (O2, NO, lipide, antibiotiques) au cation Fe de l'hème. Par exemple est-ce que le TE est un prérequis pour déclencher la réaction de dioxygénation, en permettant la fixation de O2 sur Fe(II) ? Ou est-ce que la coordination de NO sur Fe(III) permet de déclencher le TE ? Il est nécessaire répondre à ces questions avant de chercher à modéliser les étapes de réactivité entre O2, NO et Fe(II). Par ailleurs nous souhaitons étudier si la coordination du lipide est possible sur le cation fer en fonction de son état redox, et, le cas échéant, si le lipide doit être déplacé par NO ou O2. De manière plus générale les recherches entreprises au LCP sur la FHB ont pour objectifs de mieux comprendre les liens entre dynamique de la protéine, transferts d'électrons inter-domaines et fonctions biologiques. Cette recherche fondamentale a également pour objectif de nourrir la réflexion concernant le développement d'inhibiteurs spécifiques lesquels pourraient à termes servir de nouveaux antibiotiques. L'équipe de Laura Baciou au LCP étudie ce système depuis plusieurs années par des approches de biologie moléculaire et de biophysique.[4] Cette équipe a par exemple caractérisé la coordination d'antibiotiques au niveau de l'hème, et a mis en évidence la possibilité pour les protéines d'adopter deux formes (ouvertes et fermée) de la protéine. Des transitions entre ces deux conformations pourraient avoir un rôle fonctionel. L'équipe du LCP a également été la première à mesurer par radiolyse pulsée la cinétique de transferts d'électron entre la flavine semi-réduite et l'hème. Cette thèse de physico-chimie théorique sera réalisée en collaboration étroite avec l'équipe de le L. Baciou. Méthodes Nous chercherons à répondre aux questions évoquées plus haut au moyen de simulations numériques. Les approches mises en œuvre relèveront de la chimie quantique, principalement la DFT, (Density Functional Theory), de la dynamique moléculaire classique (DM) ou des approches hybrides QM/MM. Pour tenter de répondre aux questions évoquées plus haut, l'objectif sera d'établir des profils d'énergie libre correspondant aux TEs flavine-hème dans le cadre de la théorie de Marcus. Ces profils seront établis en présence ou en absence de ligands (O2, NO, lipide) sur l'hème. Ils nécessiteront l'emploi de simulations de DM et de calculs DFT pour définir les paramètres des champs de forces. La réactivité entre NO, O2 au niveau de l'hème ferreux sera entreprise à l'aide d'approches QM/MM. Les techniques nécessaires à ce travail sont déjà maîtrisées dans le groupe ThéoSim du LCP et le candidat sera donc formé à leurs utilisations.[4d, 5] Les logiciels utilisés seront NAMD ou AMBER (DM), deMon2k et Gaussian (chimie quantique) et Cuby (QM/MM). En parallèle de ce travail applicatif le candidat aura la charge de participer à l'implémentation d'un schéma QM/MM polarisable dans le logiciel deMon2k. En effet il est apparu au fil des ans que la prise en compte de la polarisabilité électronique - c.à.d. dans le présent contexte la réponse quasi-instantané du nuage électronique de l'environnement lors de l'échange d'électron entre un donneur et un accepteur - est un élément clé pour parvenir à une modélisation précise.[6] Par exemple les énergies de réorganisation de la Th. de Marcus sont fréquemment surestimées de 30-40% lorsque la polarisation électronique est négligée. Dans les schemas QM/MM que nous utilisons jusqu'à présent la densité électronique de la partie quantique est polarisée par un jeu de charges ponctuelles décrivant les atomes de l'environnement (protéine solvant). Pour prendre en compte la polarisabilité électronique l'objectif sera d'inclure le calcul des dipôles induits sur les atomes de l'environnement ainsi que de prendre en compte l'effet des dipôles induits dans l'Hamiltonien de la partie quantique.[7] Ce travail sera réalisé en collaboration avec le groupe d'AM Köster (CINESTAV, Mexique) lequel a récemment implémenté de nouveaux schémas de calculs des intégrales électroniques pour le schéma QM/MM non-polarisable dans deMon2k.[8] Le nouveau schéma QM/MM sera testé sur des systèmes simples avant d'être appliqué au cas de la FHB.

  • Titre traduit

    Numerical simulations of electron transfer in flavohemoglobin


  • Résumé

    Electron transfer(s) (ET) are basic chemical processes, with prominent importance in chemistry, physics, biology, life science, materials and microelectronics disciplines. In biology ET are involved in numerous processes like light harvesting, cellular respiratory chains, enzymatic reactions or defenses against oxidative stress. One of the main objectives for researches in this areas is to unravel the mechanisms by which natural systems manage to control the directionality, speed and efficiency of ET within proteins, noting that protein are highly inhomogeneous systems, very different from homogeneous solvents. Besides addressing fundamental questions, knowledge gained on natural systems is commonly expected to feed reflection to design innovative catalytic processes for industrial applications (see e.g. biomimetic chemistry or green chemistry), or ro inspire innovative medicinal projects; for example for the development of selective enzymatic inhibitors or of new antibiotics. In this project we will be interested in Flavohemoglobines (FHB). These are multidomain enzymes operating primarily as nitric oxide dioxygenases (NO+O2+1e- NO3-), a function that confers a protection against Reactive Nitrogen Species to the microorganisms expressing FHB (bacteria, fungi, yeast). RNS are produced by evolved organisms when they are invaded by pathogenic microorganisms. For this reason researches aiming at inhibiting FHB hold promises for the development of new and selective antibiotics. The Biophysics group of the Laboratoire de Chimie Pjhysique (LCP) (Dr. L. Baciou) has been at the forefront of this research over the last years. My PhD research program will be unwounded in tight connection with this experimental group. The catalytic mechanism of FHB is largely unknown although it is widely accepted that key chemical reactions (between NO and O2) are catalyzed at the level of the heme cofactor. However, to be reactive the heme must be preliminarily reduced, a step that requires inputs of electrons from the flavin cofactor which is situated ca. 12Å away. Understanding how electrons are sequentially injected to the heme is therefore a central point to address. A promising strategy would be to investigate the interplay between flavin-to-heme ET, chemical binding of molecules on the heme-Fe atom. For example does binding of NO is a prerequisite to enable ET from flavin to heme in normal situations? How one could inhibit FHB by blocking electron injection to the heme? Besides these questions relevant to chemical reactivity, we shall mention the fact that FHB are constituted of three protein domains that may adopt various conformations. In X-Ray structure both an open and a closed forms have been identified. Since the two form differ in part by the position of a phenylalanine residue with respect to the flavin, large conformational transitions might be part of the overall catalytic mechanism of FHB by modulating the redox properties of the flavin. We also mention the presence of a lipid inside the globin domain (below the heme) that could be bound to Fe through is one of its unsaturated C=C bonds. This lipid may have a functional role either to trigger conformational changes of the protein domains or a more local role on the catalytic reactions on the heme. A goal of my PhD work will be to better characterize these potentialities. To reach these objectives I will use theoretical and computational chemistry approaches. These approaches are gaining an ever increasing role in biochemical studies thanks to the development of efficient algorithms of powerful supercomputers. Numerical simulations can provide microscopic (atomistic) understanding of how (solvated) proteins control biological ET (see for example the pioneering works of A. Warshel, Nobel prize 2013), and as such constitute an irreplaceable complementary approach to biophysical and biochemical experiments. The ThéoSim group of LCP where I plan to do my research is worldwide recognized for their studies of biological ET with already preliminary results on FHB. The computational chemistry techniques used in this group involve classical molecular dynamics (MD), quantum chemistry approaches like Density Functional theory (DFT) or the so-called hybrid QM/MM approaches. The latter are of incredible usefulness to realistically simulate chemical reactions (e.g. ET) taking place in proteins. I will learn and use the techniques and apply them to address the scientific questions exposed above. These calculations will aim for example at calculating the ET free energy profiles in the context of Marcus Theory. ET with various ligands (NO, O2, lipid, antibiotics like azoles) bound to the heme will be investigated as well as the dioxygenation reaction itself. Now to further improve the reliability of the computed values I will attempt to implement more sophisticated methodologies. Indeed one of the physical effects not adequately accounted for by most common approaches is electronic induction: the fact that electron clouds around protein nuclei instantaneously follow the change of redox states of the cofactor. Taking into account such effects in QM/MM is crucial when modelling electron transfer. A central part of my PhD program will thus be to implement a polarizable embedding technic in the DFT program deMon2k, and to further apply it to FHB. This methodological part will require coding the calculation of new electronic integrals that reflects the electrostatic interactions between the electron clouds of the molecules of interest (heme, flavin) and the induced dipoles created on the environment (protein atoms and solvent).. This program being developed for HPC (High Performance Computing) architectures, I will learn how to achieve efficient coding of the method. deMon2k is co-developed by Dr A de la Lande in the ThéoSim group and I will benefit from his experience.