Analyse glycomique par spectrométrie de masse de fluides biologiques: Vers l'identification de nouveaux biomarqueurs de pathologies liées à des anomalies de glycosylation

par Coralie Ruel

Projet de thèse en Chimie

Sous la direction de Thuy Tran-maignan.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Sciences Chimiques : Molécules, Matériaux, Instrumentation et Biosystèmes , en partenariat avec Service de pharmacologie et d'immuno analyse (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    La glycosylation, qui est une des principales modifications post-traductionnelles des protéines, est fortement modifiée lors de diverses pathologies comme le cancer ou la polyarthrite rhumatoïde. Ainsi, la nature et les proportions relatives des oligosaccharides liés aux protéines peuvent être utilisées comme paramètres déterminants pour diagnostiquer, pronostiquer voire suivre le développement de pathologies. Dans ce cas, les différences de glycosylation signent généralement des dysfonctionnements métaboliques affectant la production des glycoprotéines. Des troubles métaboliques affectant non plus la synthèse mais le catabolisme des oligosaccharides liés aux protéines existent également. Par exemple, les oligosaccharidoses font partie d'un groupe de maladies dites 'de surcharge lysosomale' qui entraînent une accumulation de matériel glucidique au sein des lysosomes, avant d'être à terme éliminé dans les urines et le plasma des patients. Ainsi, l'analyse glycomique permet de mettre en lumière des modifications caractéristiques des profils oligosaccharidiques plasmatiques ou urinaires pour le diagnostic de diverses pathologies. Le but de cette thèse est de répondre à des problématiques de diagnostic en développant une plateforme pour l'analyse d'oligosaccharides libres et liés aux protéines au sein de diverses matrices biologiques (e.g. plasma, urine) en mettant en place des stratégies analytiques automatisées. Un des objectifs principaux sera d'automatiser les étapes de préparation d'échantillon en développant un module d'enrichissement des glycannes à partir de fluides biologiques sur des phases monolithiques fonctionnalisées qui sera couplé en ligne à leur analyse par chromatographe liquide haute performance (CLHP) et électrophorèse capillaire (EC). La séparation difficile des oligosaccharides de structures très proches (notamment des isomères présents naturellement pour un même oligosaccharide) sera réalisée par des méthodes orthogonales (CLHP et EC) en exploitant leur pouvoir séparatif élevé. Le couplage direct de ces techniques avec la spectrométrie de masse (SM) à haute résolution (Orbitrap, Q-TOF) permettra d'obtenir une grande sensibilité de détection mais également d'exploiter la sélectivité de la SM et de réaliser des analyses structurales par SM/SM. Les outils développés seront ensuite appliqués à l'étude de l'encéphalopathie hépatique (collaboration avec le Pr. D. Thabut, Groupement Hospitalier Pitié-Salpêtrière-Charles Foix, Paris) ou de troubles hépatiques (collaboration franco-indienne en cours de mise en place, Dr. Richard Moreau, Hôpital Beaujon, Paris et Pr. Shiv Sarin, Institute of Liver and Biliary Sciences, New Delhi, Inde). Le travail de thèse comportera à la fois des aspects analytiques et techniques innovants liés notamment à l'utilisation de la spectrométrie de masse à très haute résolution ainsi que du couplage EC-SM mais également du couplage en ligne monolithe/EC ou CL. Ce travail permettra à l'étudiant d'acquérir des compétences pluridisciplinaires à l'interface de la chimie et de la biologie.

  • Titre traduit

    Mass spectrometry-based glycomics of biological fluids: towards the identification of a novel class of disease biomarkers


  • Résumé

    Mass spectrometry-based glycomics of biological fluids: towards the identification of a novel class of disease biomarkers Glycosylation is one of the most complex types of post-translational modifications of proteins. Changes in protein glycosylation play an important role in various pathologies, such as cancer or inflammatory arthritis. Disease-associated modifications in protein glycosylation constitute a major source of biomarkers and are often exploited for diagnosis. Differences in glycosylation can be synonymous of defects in glycoprotein biosynthesis, while other metabolic disorders may also affect the catabolism of glycoproteins. For example, oligosaccharidosis is part of a group of diseases called “lysosomal storage disorders”, which lead to an accumulation of oligosaccharides within the lysosomes before a release in urine or plasma. Thus, glycomic analysis can be used to highlight characteristic modifications of plasmatic or urinary oligosaccharide profiles, to further diagnose and monitor different pathologies. The goal of this PhD thesis is to solve some of the existing issues regarding disease diagnostic, by implementing an analytical platform for the analysis of free and protein-bound oligosaccharides within different biological matrices (e.g. plasma, urine). One of the main objectives aims at automatizing the sample preparation by developing a module involving a monolithic support for efficient enrichment of glycans from biofluids. This device will be used on-line with orthogonal techniques such as high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis system for the efficient resolution of isomeric oligosaccharide structures. Such separation system will be coupled to high resolution mass spectrometry (Orbitrap or Q-TOF) for high-sensitivity detection but also for its specificity and its ability to characterize unknown compounds through MS/MS experiments. The different analytical tools developed in this project will be applied to the study of hepatic encephalopathy (collaboration with Pr. D. Thabut, “Groupement Hospitalier Pitié-Salpêtrière-Charles Foix”, Paris) or other hepatic disorders (collaboration currently being set up between France and India, Dr. Richard Moreau, Beaujon hospital, Paris and Pr. Shiv Sarin, Institute of Liver and Biliary Sciences, New Delhi, India). This thesis will be performed under joint supervision between the « Proteins and Nanotechnology in Analytical Science » (PNAS, Institut Galien Paris sud, UMR CNRS 8612) laboratory headed by Myriam Taverna, and “le Laboratoire d'Etude du Métabolisme des Médicaments” (LEMM, CEA Saclay) directed by Christophe Junot. The student will benefit from the complementary expertise of these two laboratories. The PNAS laboratory has more than 20 years of experience in the field of protein glycosylation, and is well recognized for its expertise in capillary electrophoresis and sample preparation. The LEMM activities are centered around the development of MS-based metabolomic, lipidomic and glycomic approaches for the discovery of biomarkers to diagnose and monitor diseases. The thesis work will imply innovative techniques, such as the coupling of capillary electrophoresis or liquid chromatography to high-resolution mass spectrometry with on-line monolith-based sample preparation. This will enable the student to acquire multidisciplinary skills at the chemistry/biology interface.