Développement de nanomédicaments innovants pour le traitement de l'ischémie hépatique

par Marie Rouquette

Projet de thèse en Pharmacotechnie et biopharmacie

Sous la direction de Patrick Couvreur et de Sinda Lepetre-mouelhi.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut Galien Paris-Sud (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 24-12-2015 .


  • Résumé

    De nombreux médicaments ou candidats médicaments présentent des caractéristiques physico-chimiques peu favorables au passage des barrières biologiques qui séparent le site d'administration du médicament de son site d'action. Ces barrières mécaniques, physico-chimiques ou enzymatiques rendent l'obtention de concentrations efficaces au niveau du site d'action très difficile et provoquent des déperditions importantes de la molécule active vers d'autres tissus générant ainsi des effets toxiques parfois rédhibitoires pour le traitement. Ces problèmes ont pu être partiellement résolus grâce au concept de « squalénisation », mis au point dans notre laboratoire. Ce concept consiste à coupler un principe actif à une molécule lipophile (à 6 unités isoprènes) dérivée du squalène via une liaison covalente (ester ou amide) générant ainsi des prodrogues amphiphiles qui ont la capacité unique de s'auto-assembler spontanément en milieu aqueux sous forme de nanoparticules d'une centaine de nanomètres de diamètre, permettant ainsi leur administration par voie intraveineuse. La squalénisation a tout d'abord été appliquée à des analogues nucléosidiques à activité anticancéreuse ou antivirale, antibiotiques. Récemment, notre laboratoire a montré que la squalénisation de l'adénosine (molécule hydrophile endogène à temps de demi-vie très court) permettait de régénérer des lésions conséquentes à l'ischémie cérébrale et au traumatisme de la moelle épinière. A l'occasion de cette étude, il a été observé que le traitement par les nanoparticules d'adénosine-squalène (Ad-SQ) permettait la production de concentrations importantes d'adénosine au niveau du tissu hépatique. Le projet de thèse vise maintenant à utiliser ces nanoparticules pour le traitement du syndrome d'ischémie/reperfusion (I/R) rencontré lors de la phase initiale de la transplantation hépatique. De toute évidence, il s'agit d'un projet ambitieux qui répond à un important challenge médical et thérapeutique ; il sera réalisé en collaboration avec l'équipe du Professeur Sa Cunha (transplantation hépatique, hôpital Paul Brousse). Les étapes de la transplantation du foie, allant du prélèvement et de la conservation de l'organe (phase d'ischémie) jusqu'à son implantation (reperfusion) induisent des lésions de nécrose, puis d'apoptose hépatocytaire, initiées par le stress oxydatif. Ainsi, l'arrêt du flux sanguin au niveau du greffon lors de la transplantation conduit à l'ischémie hépatique. Cette phase ischémique induit une diminution brutale de l'apport en dioxygène et en substrats énergétiques, provoquant ainsi la déplétion en ATP et l'altération de l'homéostasie ionique (ions H+, Na+, Ca2+). Ce phénomène engendre l'activation des enzymes hydrolytiques puis le gonflement des cellules endothéliales sinusoïdales et de Kupffer. Des lésions cellulaires irréversibles, essentiellement par nécrose, peuvent alors apparaître. La reperfusion (reprise de la circulation sanguine dans le tissu), reste le seul moyen de «sauver» l'organe ischémié. De façon paradoxale, la reperfusion engendre la formation de radicaux libres dérivés de l'oxygène provoquant ainsi des dommages encore plus graves. En effet, la réintroduction brutale de l'oxygène en grande quantité dans les cellules lors de la reperfusion, provoque une saturation en oxygène, due au dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitonchondriale causée par l'ischémie. La réactivation des pompes ioniques provoque une surcharge sodique puis calcique, potentiellement très délétère pour la cellule, car elle engendre l'activation de nombreuses enzymes (protéases, lipases, NO synthases, déshydrogénases,. . .) qui génèrent directement ou indirectement une production accrue d'espèces radicalaires de l'oxygène. Cet excès de ROS a des effets délétères pour le fonctionnement cellulaire. Il conduit en particulier à la lésion des membranes cellulaires (dont la membrane mitochondriale) via le phénomène de peroxydation lipidique. Mais il mène également à une activation indirecte de l'inflammation, en recrutant les leucocytes et en stimulant la production de cytokines pro-inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale (TNF-alpha) et l'Interleukin-1(IL-1) aboutissant à l'apoptose. Des travaux ont montré que l'activation des récepteurs de l'adénosine se trouvant à la surface cellulaire générait un rôle cyto-protecteur (anti-apoptotique, anti-inflammatoire, et anti-nécrotique) vis-à-vis du tissu hépatique. Il a également été décrit que l'activation des récepteurs de l'adénosine se trouvant sur les neutrophiles et les monocytes pouvait agir sur la régulation des fonctions leucocytaires par inhibition du TNF-alpha, de l'IL-6 et de l'IL-8. Ces derniers sont produits par les monocytes humains qui sont stimulés par les lipopolysaccharides via les récepteurs A2. D'autre part, il a été rapporté que l'adénosine pouvait inhiber la génération d'espèces réactives oxygénées, l'agrégation des neutrophiles, ainsi que l'adhérence des neutrophiles aux cellules endotheliales. De plus, comme les leucocytes sont impliqués lors des lésions hépatiques générés par l'I/R, il est également possible que l'adénosine puisse prévenir ces lésions en inhibant l'activation des leucocytes via les récepteurs A2 de l'adénosine. Enfin, il est à noter que l'adénosine joue un rôle très important au niveau de la transplantation hépatique, car étant l'un des principaux constituants des solutions de conservation des greffons, elle permet d'assurer le maintien du pool énergétique. Ainsi, nous formulons l'hypothèse que la « squalénisation » de l'adénosine exercera un effet hépatoprotecteur au niveau du foie ischémié (comparativement à l'adénosine libre). En effet, sous forme de nanoparticules, l'adénosine est susceptible d'être acheminée de manière intacte au sein des hépatocytes, en étant protégée de la métabolisation enzymatique. Les nanoparticules d'Ad-SQ constitueraient donc un véritable réservoir d'adénosine à destination du foie. En permettant la libération progressive de l'adénosine, elles maintiendront, en effet, un pool énergétique à proximité directe des hépatocytes, de manière durable et efficace. Dans ce contexte, il est aussi envisagé de synthétiser de nouveaux bioconjugués d'adénosine, à partir d'autres homologues du squalène (avec des longueurs de chaine différentes), de les formuler sous forme de nanoparticules et de comparer leur activité par rapport aux nanoparticules d'Ad-SQ contenant 6 unités isoprènes.

  • Titre traduit

    Development of innovative nanomedicines for the treatment of liver ischemia reperfusion injury


  • Résumé

    Many drugs or drugs candidates present unfavorable physico-chemicals properties in order to cross biological barriers that separate the drug administration site from its site of action. These barriers, whether mechanical, physico-chemical or enzymatic, make it hard to obtain efficient concentration at the site of action and provoke important losses of the active molecule in other tissues, generating toxic effects that can be prohibitive for the treatment. These problems could be partially resolved by the concept of "squalenisation" that was designed in our lab. This concept consists in coupling the active substance to a squalene-derived lipophilic molecule (bearing 6 isoprene units) by a covalent link (ester or amide), hence generating amphiphilic prodrugs. These prodrugs can spontaneously auto-assemble in aqueous medium to form 100nm-diameter nanoparticules, which can be injected intravenously. Squalenisation was first applied to nucleoside analogs showing anticancer, antiviral or antibiotic activities. More recently, our lab demonstrated that a squalenilated adenosine (an endogenous hydrophilic molecule with very short half-life) could regenerate the brain after cerebral ischemia or the spinal cord after a trauma. It was also shown that the treatment with squalene-adenosine (SQ-Ad) nanoparticules produced important adenosine concentration in the liver. My PhD project now aims to use these nanoparticules for treating ischemia-reperfusion injuries happening during the initial phase of liver transplant. This clearly is an ambitious project which answers an important medical and therapeutical need; it will be realized in collaboration with Prof. Sa Cunha's team (liver transplant, Paul Brousse hospital). Liver transplantation, from organ removal and conservation (ischemia phase) to implantation (reperfusion phase), induce necrosis damages and hepatocytes apoptosis initiated by oxidative stress. In other words, stopping the graft blood flow for transplantation leads to liver ischemia. This ischemic phase induces a strong decrease in oxygen and energetics substrates inflow, leading to ATP depletion and a disruption of ion homeostasis (H+, Na+, Ca2+ ions). This phenomenon causes the activation of hydrolitic enzymes and the swelling of sinusoidal endothelial cells and Kupffer cells. Irreversible cell damage (mainly by necrosis) can appear. Reperfusion (blood flow reestablishment) remains the only way to "rescue" the organ. Paradoxically, reperfusion induces free radicals formation from oxygen, causing even more severe damages. Indeed, suddenly reintroducing a great quantity of blood in the cells during reperfusion causes oxygen saturation because of mitochondrial respiratory chain dysfunction due to ischemia. Ionic pumps reactivation provokes sodium and calcium overloads which can be very noxious for the cell because they lead to numerous enzymes activation (proteases, lipases, NO synthetases, dehydrogenases...) generating, in direct or indirect way, an increased production of radical oxygen species. This ROS excess has noxious effect on cell metabolism. It notably leads to cell membrane (and mitochondrial membrane) damage via lipid peroxidation. But it also provokes an indirect activation of the inflammation process by recruiting leukocytes and stimulating pro-inflammatory cytokines production as tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin-1 (IL-1), leading to apoptosis. It was shown that the activation of adenosine receptors located at the cell surface could generate a cytoprotective effect (anti-apoptotic, anti-inflammatory and anti-necrotic) in the liver tissue. It was also evidenced that the activation of adenosine receptors on neutrophils and monocytes could act on the leukocytes functions by inhibiting TNF-alpha, IL-6 and IL-8. These are produced by human monocytes that were stimulated by lipopolysaccharides via A2 receptors. Furthermore, adenosine was reported to inhibit ROS generation, neutrophils aggregation and adherence to endothelial cells. Moreover, as leukocytes are implicated in liver damage caused by ischemia-reperfusion, it is possible that adenosine prevents these damages by inhibiting leukocytes activation by A2 receptors. Finally, it is worth mentioning that adenosine plays a very important role in liver transplant as one of the major component of the graft preserving solutions, insuring a stable energetic pool. As a result, we formulate the hypothesis that adenosine "squalenisation" will exert a hepatoprotective effect on the ischemic liver (compared to free adenosine). Indeed, as nanoparticules, adenosine can be routed intact into the hepatocytes as it is protected from enzymatic degradation. SQ-Ad nanoparticules could form an important adenosine reservoir for the liver. By progressively releasing adenosine they will maintain an energetic pool in close proximity with the hepatocytes, in a sustainable and efficient way. In this idea, we also consider synthesizing new adenosine bioconjugates from other squalene homologues (with different chain length), formulating them as nanoparticules and comparing their activity with SQ-Ad bearing 6 isoprene units.