Stereostructural studies and biological activities of secondary metabolites from marine sources

par Germana Esposito

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Marie-Lise Bourguet-Kondracki et de Valeria Costantino.

Thèses en préparation à Paris, Muséum national d'histoire naturelle en cotutelle avec l'Universita Fedérico II Naples , dans le cadre de École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris) depuis le 09-02-2015 .

  • Titre traduit

    Études stéréostructurales et activités biologiques des métabolites secondaires provenant de sources marines


  • Résumé

    Dans le cadre de la recherche de nouvelles molécules d’origine marine, mon attention a été en particulier centrée sur l'analyse chimique de deux éponges marines du genre Smenospongia et sur l’éponge Achantostrongylophora ingens. A partir de l’éponge S. aurea, deux nouveaux métabolites bioactifs de structure hybride peptidique/polycétide, smenothiazoles A et B, ont été isolés. Ils ont été testés contre quatre lignées cellulaires de tumeurs solides et ont montré une activité cytotoxique à des concentrations nanomolaires, avec une sélectivité contre les cellules cancéreuses de l'ovaire et un mécanisme pro-apoptotique. L'étude de l'éponge S. conulosa a révélé la présence de deux composés chlorés supplémentaires les conulothiazoles A et B, en plus des smenothiazoles précédemment isolés. Cependant, il n'a pas été possible d'évaluer l'activité anticancéreuse de ces composés en raison de la quantité limitée de produits isolés. L'analyse chimique de l'éponge Achantostrongylophora ingens a conduit à la découverte d’un nouvel inhibiteur de protéines kinases, le chloromethylhalicyclamine B, ainsi que de l’halicyclamine B, déjà connue. Le nouveau composé est le résultat de la réaction entre l’halicyclamine B avec le CH2CI2 utilisé au cours de l’extraction. Cependant, contrairement au produit original, le nouveau dérivé se trouve être actif un inhibiteur sélectif de la protéine kinase CK1δ/ε avec une IC50 de 6 µM. La configuration absolue du chloromethylhalicyclamine B a été déterminée par prédiction quantomécanique de son spectre de ECD. De plus, la conformation de nouvelle molécule a été déterminée par des études computationnelles et a été confirmée par les données de NOESY. Des études de docking moléculaire ont aussi été effectuées afin d’évaluer l'arrangement de la molécule sur le site de liaison de l'ATP de la CK1δ. Bien que la structure globulaire de ce composé soit très différente de celle des inhibiteurs déjà connus de CK1δ, l'analyse a révélé que le logement dans le site de liaison était optimal. Pour cette raison, le chloromethylhalicyclamine B peut être considérée comme un nouveau type structural d'inhibiteur CK1δ/ε. Une autre partie de mon travail a porté sur la recherche de molécules impliquées dans le mécanisme du quorum sensing afin de contrôler la communication entre les bactéries et donc, par conséquent, leur virulence. Le plus souvent, les molécules impliquées dans ce processus sont les homosérinelactones acylées (AHL). J’ai analysé l’extrait de la bactérie marine Paracoccus sp. afin de détecter la présence de AHL. Douze AHLs saturées à chaîne longue, et quatre AHL insaturées à longue chaîne ont été trouvées dans l'extrait de Paracoccus confirmant la possibilité d'avoir un mécanisme de quorum sensing dans des conditions particulières. Il convient de souligner que d'autres petites molécules telles que dicétopiperazines (DKPs) sont capables d'influencer le mécanisme de quorum sensing. Pour cette raison, nous avons déterminé, par la méthode de Marfey, la configuration absolue de 7 dicétopiperazines déjà connues isolées de l'éponge marine Acanthostrongylophora ingens. De cette façon, nous avons créé une banque de DKPs qui ont été évaluées pour leur activité de quorum quenching. Les résultats préliminaires ont montré que tous les composés ont une activité inhibitrice du QS contre E. coli pSB1075 (longue chaîne gène reporter) avec une CMI de 70 µM, alors qu'aucun composé ne présente d’activité inhibitrice de QS contre E. coli pSB401 (gène reporter à chaîne courte). Les résultats obtenus contribuent à une meilleure connaissance de la diversité chimique des éponges et bactéries associées et la proposition de nouveaux squelettes bioactifs.


  • Résumé

    Within the marine ecosystem, the sessile organisms such as Porifera are considered the most interesting phylum by the natural products chemists. Sponge derived natural products belong to many different chemical classes, including polyketides, terpenoids, peptides and alkaloids, and show a wide range of pharmacological activities such as anticancer, antibacterial, antifungal, antiviral and anti-inflammatory activities. For this reason these compounds can be used as lead compounds in drug discovery. The research work described in this PhD thesis belongs to this research field. In particular, my attention was focused on the chemical analysis of the sponge of the genus Smenospongia. Two new bioactive secondary metabolites with a hybrid structure peptide/ polyketide, smenothiazoles A and B, were isolated from the sponge S. aurea. Smenothiazoles were tested against four solid tumor cell lines and showed a potent cytotoxic activity at nanomolar levels with selectivity against ovarian cancer cells and a pro-apoptotic mechanism. The analysis of the congeneric sponge species, S. conulosa, revealed the presence of two additional chlorinated compounds, conulothiazoles A and B together with smenothiazoles. However, the anticancer activity of these compounds cannot be evaluated because of the low amount isolated from the sponge. My work during these three years regarded also the chemical analysis of the MeOH crude extract of the sponge Achantostrongylophora ingens which revealed protein kinase inhibitory activity. The bioguided fractionation of this extract led to the isolation of a new halogenated alkaloid, chloromethylhalicyclamine B, together with the known natural compound halicyclamine B. The new compound is the result of the reaction between halicyclamine B and CH2Cl2 used for the extraction. However, in contrast to the known halicyclamine B, the new derivative revealed to be a selective CK1δ/ε inhibitor with an IC50 value of 6 μM. The absolute configuration of chloromethylhalicyclamine B was determined by quantum mechanical prediction of its ECD spectrum. The conformation assumed by the new molecule was also determined by computational studies and was validated by NOESY data. Docking studies were also performed in order to evaluate the accommodation of the molecule in the ATP binding site of CK1δ. Even if the globular structure of this compound is very different from that of already known CK1δ inhibitors, the analysis revealed that the accommodation in the binding site is good. Therefore, these data showed chloromethylhalicyclamine B as a new structural type of CK1δ/ε inhibitor. Another part of my work has been addressed to the search for molecules involved in quorum sensing mechanism in order to control the communication between bacteria and thus their virulence. The most frequent molecules involved in this process are the acylated homoserinelactone compounds (AHLs). I analyzed the extracts of the marine bacteria Paracoccus sp. in order to detect the presence of AHLs. Twelve saturated long-chain AHLs, along with four putative unsaturated long-chain AHLs were found in Paracoccus extract confirming the possibility to have quorum sensing in particular conditions. It is noteworthy that other small molecules like diketopiperazines (DKPs) are able to influence the quorum sensing mechanism. For this reason, we determined the absolute configuration by Marfey’s method of 7 known diketopiperazine isolated from the marine sponge Acanthostrongylophora ingens. In this way we created a library of DKPs that were evaluated for their quorum quenching activity. Preliminary results showed that all compounds exhibit QS inhibitory activity against E.coli pSB1075 (long chain gene reporter) with MIC of 70 µM, while none compounds show QS inhibitory activity against E.coli pSB401 (short chain gene reporter) at low concentrations where in addition the bioluminescence increases at high concentration ≥ 70 µM.