Modification ciblée de la marque H3K9me3 des répétitions péricentromériques

par Sheldon Decombe

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire

Sous la direction de Emmanuelle Delagoutte et de Judith Lopes.


  • Résumé

    Le centromère est un élément fondamental de la cellule, très conservé dans l’évolution. Chez l’humain, il est composé de séquences d’ADN répétées en tandem très abondantes, appelées séquences a-satellites. Le centromère joue un rôle central dans le cycle cellulaire et est défini de façon épigénétique par la présence du variant de l’histone H3 appelé CENP-A. Les régions flanquantes, dites péricentromères, sont caractérisées par une chromatine compacte (hétérochromatine), qui comporte plusieurs marques épigénétiques particulières (dont H3K9me3) conférant un statut chromatinien répressif pour la transcription. La grande conservation, dans les cellules eucaryotes, de ces marques chromatiniennes laisse suggérer un rôle important de ces structures dans l’assemblage et le fonctionnement du centromère. Cependant, si le rôle de CENP-A au niveau du centromère est bien décrit, celui de la marque H3K9me3 péricentromérique l’est beaucoup moins. Afin de l’élucider, nous avons mis au point un outil de ciblage spécifique des séquences d’ADN a-satellites par une protéine TALE. Notre expertise de ces séquences nous a permis de concevoir une TALE ciblant spécifiquement la région péricentromérique du chromosome 7 humain. La fusion d’une histone lysine déméthylase à cette protéine TALE permet d’observer par immunofluorescence, dans un modèle cellulaire, une déméthylation de H3K9 dans la région péricentromérique de ce chromosome. La combinaison d’analyses en microscopie photonique conventionnelle et à super-résolution (PALM), nous a permis de mettre en évidence une augmentation du volume occupé par la TALE sur sa région cible, suggérant une décompaction locale de la chromatine. Nous avons recherché l’impact de la perte de triméthylation de H3K9 sur le recrutement d’un certain nombre de protéines des régions centromériques et pu observer, par immunofluorescence, une diminution de l’abondance de la protéine HP1 au péricentromère durant l’interphase, ainsi que des protéines du CPC. L’étude de la ploïdie réalisée par hybridation fluorescente in situ sur un grand nombre de noyaux interphasiques, révèle une augmentation de 64% de l’instabilité chromosomique spécifique du chromosome ciblé par la TALE. Ces résultats apportent un élément de réponse quant au rôle de la marque H3K9me3 dans la fonction du centromère et ouvrent la voie à une étude de l’interaction fonctionnelle entre CENP-A et l’hétérochromatine péricentromérique.


  • Résumé

    The centromere is a crucial component of the cell, very conserved throughout evolution. In humans, it is composed of highly abundant tandemly repeated DNA sequences called a-satellites. The centromere plays a prominent role during the cell cycle and is epigenetically defined by the presence of the histone H3 variant CENP-A. Flanking regions, termed pericentromeres, are characterized by a condensed chromatin (heterochromatin), bearing several specific epigenetic marks (including H3K9me3) giving it a repressive transcription status. The wide conservation, in eukaryotic cells, of these chromatin marks suggests an important role of these structures for the centromere assembly and function. However, if the role of CENP-A at the centromere is well described, it is far less so for pericentromeric H3K9me3. In order to shed light on this question, we developed a tool for specific targeting of a-satellite DNA sequences using a TALE protein. Using our knowledge of these sequences, we designed a TALE specifically targeting the pericentromeric region of human chromosome 7. Fusing a histone lysine demethylase to this TALE in a cellular model enabled us to observe a demethylation of H3K9 in the pericentromeric region of that chromosome using immunofluorescence. Combining conventional optical microscopy and super-resolution microscopy (PALM) analyzes, we showed that the TALE occupies an increased volume on its target, suggesting a local chromatin decompaction. We investigated the consequences of the loss of H3K9 trimethylation upon the recruitment of various pericentromeric proteins and observed, using immunofluorescence, decreased levels of HP1 and CPC proteins at the pericentromere during interphase. The investigation of ploidy levels over a large number of interphase nuclei using fluorescent in situ hybridization revealed a 64% increase in chromosomal instability for the TALE-targeted chromosome. These results bring us one step closer to understanding the full role of H3K9me3 in the centromere function and open the way for the study of functional interactions between CENP-A and pericentromeric heterochromatin.