Développement de stratégies de criblage de mutations d'épissage dans des gènes de prédisposition au cancer.

Development of strategies for screening for splice mutations in cancer susceptibility genes

• Auteur / Autrice : Helene Tubeuf
• Direction : Alexandra Martins
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moleculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 16/04/2019
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer and Brain Genomics (Rouen ; 2022-....) - Génomique et Médecine Personnalisée du Cancer et des Maladies Neuropsychiatriques
• Partenaire(s) de recherche : Établissement de préparation : Université de Rouen Normandie
• Jury : Président / Présidente : Pascale Fanen
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alexandra Martins, Pascale Fanen, Laurent Corcos, Thierry Frébourg
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Dominique Stoppa-Lyonnet, Sylvie Tuffery-Giraud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Analyse fonctionnelle

Bioinformatique

Épissage (génétique)

Variabilité génétique

Maladies héréditaires

Mots clés libres

Cancer héréditaire

Interprétation des variations génétiques

Régulation de l'épissage de l'ARN

Prédictions bioinformatiques

Analyses fonctionnelles

Hereditary cancer

Interpretation of genetic variation

MRNA splicing regulation

Bioinformatics predictions

Functional analyses

Résumé

Le développement du séquençage de l’ADN à haut débit a grandement facilité le criblage de variations génétiques dans le génome des patients. Désormais, l’un des principaux défis de la génétique médicale n’est donc plus la détection des variations, mais leur interprétation fonctionnelle et clinique. Récemment, nous avons montré, à l’aide de tests fonctionnels basés sur l’utilisation de minigènes, que bien que le nombre de mutations d’épissage, et en particulier celles qui affectent sa régulation, est actuellement sous-estimé, l’effet de ces variations pourrait être dorénavant prédit à l’aide d’outils bioinformatiques spécifiques. Nous avons ainsi étendu l’évaluation du caractère prédictif de ces quatre nouvelles approches bioinformatiques par une étude comparative des scores générés par ces approches avec des données expérimentales obtenues pour un total d’environ 1200 variations exoniques. Nos travaux ont ainsi démontré la fiabilité de ces approches, utilisées seules ou en combinaison, et ont permis de proposer des recommandations quant à leur utilisation en tant qu’outils de filtration pour prioriser les variations à analyser dans des tests fonctionnels axés sur l’épissage. Néanmoins, une analyse mutationnelle exhaustive ciblée sur l’exon 7 de MLH1, a mis en évidence l’échec apparent de ces approches, pourtant validées par des études menées sur l’exon 7 de BRCA2, l’exon 10 de MAPT et l’exon 5 de MSH2, laissant suggérer que ces méthodes pourraient ne pas s’appliquer de manière équivalente à tous les exons et/ou à tous les gènes. En effet, nous avons montré que cet exon était doté de caractéristiques particulières, i.e. de sites d’épissage remarquablement forts, lui conférant une résistance totale aux mutations de régulation d’épissage et mettant en échec les outils de prédictions. Ces données contribuent à mieux déterminer les limitations de ces outils bioinformatiques tout en contribuant à leur amélioration. En dépit de ces avancées, l'évaluation de la pathogénicité des mutations d'épissage reste complexe, en particulier celles conduisant à des anomalies d'épissage en phase et/ou partielles. En utilisant, comme modèle d’étude, des variations à l’origine du saut partiel de l’exon 3 de BRCA2, nos résultats ont révélé que l’activité tumeur-suppressive de BRCA2 tolère une réduction substantielle du niveau d’expression, étant donné qu’un allèle produisant jusqu’à 70% de transcrit codant une protéine déficiente n’est pas nécessairement associé à un risque élevé de développer un cancer. L’ensemble de ces données a d’importantes implications dans le diagnostic moléculaire et la prise en charge des patients et de leurs apparentés, avec un bénéfice direct pour les familles évocatrices d’une prédisposition héréditaire et devrait contribuer à l’interprétation de VSI identifiées par séquençage à haut débit dans toute autre pathologie d’origine génétique.

The development of high-throughput DNA sequencing has greatly facilitated the screening of genetic variations within patient genome. Henceforth, one of the main challenges in medical genetics is no longer the detection of variations, but their functional and clinical interpretation. Recently, we showed by using splicing reporter minigene assays, that although splicing mutations, and in particular those affecting its regulation, are more prevalent than initially estimated, they could now be predicted by using dedicated bioinformatics tools. We thus extended the evaluation of the predictive power of these four newly developed computational approaches by a comparative study of the scores obtained by these approaches with experimental data for a total of about 1200 exonic variations. Our findings have demonstrated the reliability of these approaches, used alone or in combination, and allow to offer recommendations for their use as a filtration tool to prioritize the variations to be analysed as a priority in splicing-dedicated functional assays. Nevertheless, an exhaustive mutational analysis targeting MLH1 exon 7, has highlighted the apparent failure of these approaches, yet validated by studies focused on BRCA2 exon 7, MAPT exon 10 and MSH2 exon 5, suggesting that these methods might not be equivalently applicable to all exons and/or genes. Indeed, we have shown that this exon has particular characteristics, i.e. remarkably strong splice sites, conferring it a total resistance to splicing regulation mutations and defeating prediction tools. These findings help to better determine the limitations of these bioinformatics tools while contributing to their improvement. In spite of these advances, the pathogenicity assessment of splicing mutations remains complicated, especially of those leading to in-frame and/or partial splicing anomalies. By using variant-induced partial BRCA2 exon 3 skipping as a model system, we showed that BRCA2 tumor suppressor function tolerates a substantial reduction in expression level, as BRCA2 allele producing as much as 70% of transcript encoding deficient protein may not necessarily confer high-risk of developing cancer. Altogether, these data have important implications in the molecular diagnosis and clinical management of patients and their relatives, with a direct benefit for hereditary cancer-suspected families and should contribute to the interpretation of VSI identified by high throughput sequencing in any other genetic disease.