Rôle du médiateur et des cohésines dans la réparation des dommages oxydatifs de l'ADN

par Emilie Lebraud (L'ecuyer)

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Anna Campalans.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec Stabilité génétique, cellules souches et radiations (laboratoire) , LRIG - Laboratoire de recherche sur l'instabilité génétique (equipe de recherche) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Notre laboratoire s'intéresse au système de réparation de bases (BER), responsable de l'élimination des bases lésées dans l'ADN, le type de dommage le plus abondant généré spontanément ou par des stress induits par des agents exogènes tels que les radiations ionisantes ou des agents chimiques. Nous avons caractérisé les protéines essentielles et accessoires du BER et leurs interactions par des approches biochimiques et génétiques. Plus récemment nous avons essayé de comprendre comment les complexes permettant un fonctionnement efficace du BER sont assemblés dans le contexte du noyau cellulaire en réponse à des stress génotoxiques en utilisant des approches de biologie cellulaire. Ainsi nous avons pu constater que des « usines de réparation BER » se forment suite à des traitements générant des bases oxydées dans l'ADN cellulaire. Ces complexes incluent les enzymes essentielles du BER (l'ADN glycosylase, l'AP endonucléase, Polbeta, et la Ligase 3) ainsi que la protéine d'échafaudage qui coordonne les processus, XRCC1. Très récemment par des études de microscopie in vivo nous avons confirmé le modèle, que nous avions proposé basés sur les données de biochimie, dans lequel, pour le cas de la lésion mutagène 8-oxoguanine l'assemblage du complexe BER dépend du recrutement à la chromatine d'OGG1, l'ADN glycosylase qui reconnaît et excise la lésion. De manière surprenante, le recrutement de cette protéine initiatrice de la réparation ne nécessite pas la reconnaissance de la lésion par la protéine. Effectivement, un mutant d'OGG1 ayant perdu l'affinité de la protéine pour la base oxydée est efficacement recrutée à la chromatine en réponse au stress oxydant. Cela implique qu'il existe des signaux autres que la reconnaissance de la base modifiée par OGG1 qui permettent le recrutement de l'enzyme à la chromatine et ainsi l'initiation de la réparation de la 8-oxoG par le BER. Des résultats préliminaires du laboratoire suggèrent que ceci serait vrai pour le recrutement des glycosylases responsables de l'excision d'autres bases oxydées. Le projet proposé consiste à identifier des nouveaux composants du système BER nécessaires au recrutement de la glycosylase OGG1 à la chromatine suite à l'induction de 8-oxoG dans l'ADN cellulaire. Nous avons mis en place un crible siRNA à haut débit pour détecter des gènes impliqués dans le recrutement d'OGG1. Le « read-out » du crible est une détection des siRNA affectant le recrutement d'une forme fluorescente fonctionnelle de l'ADN glycosylase à la fraction chromatinienne. L'imagerie cellulaire et la biochimie ont permis de mettre en évidence le rôle essentiel de certaines sous-unités du médiateur de la transcription dans le recrutement chromatinien d'OGG1. Un premier objectif de la thèse sera donc d'analyser plus précisément le rôle du médiateur dans le recrutement de cette ADN glycosylase suite à un stress oxydatif. De plus, nos propres résultats ainsi que des données de la littérature suggèrent une relation très étroite entre le processus de transcription et la réparation de différents types de lésions de l'ADN telles que des dommages induits par les UV et les cassures double brin. Un second objectif sera donc également de comparer les résultats obtenus jusqu'ici avec un agent carcinogène (le bromate de potassium), avec les effets induits par les rayonnements ionisants tels que les rayons X ou les rayons gamma. Enfin, une perspective à long terme serait d'étudier les effets du stress oxydatif sur la réparation de la 8-oxoguanine chez l'animal. Nous disposons actuellement de souris mutées OGG1-/- ainsi que de souris wild type qui nous serviraient de modèle d'étude. L'impact d'un défaut des gènes identifiés sur le recrutement d'OGG1, ainsi que les autres protéines du BER, aux sites de dommages sera évalué en microscopie confocale sur cellules fixées et vivantes. Par la suite, nous procéderons à caractériser le rôle du gène dans la cascade d'évènements qui mènent à l'initiation de la réparation proprement dite. Les effets d'inhiber la fonction du/des gènes candidats seront évalués en déterminant des paramètres comme la survie cellulaire face à des stress génotoxiques, la capacité des cellules à réparer in vivo des lésions spécifiques de l'ADN, les possibles interactions physiques des protéines avec des éléments connus du BER, l'interférence avec ces interactions par l'utilisation de mutants ou polymorphismes. L'identification des mécanismes moléculaires ainsi que des nouveaux facteurs impliqués dans la réparation de bases oxydées pourrait être utilisée dans la conception de nouvelles thérapies. Par exemple elle pourrait fournir des éléments pour le choix d'agents chimiothérapeutiques ou lors des radiothérapies d'agents qui optimiseraient les réponses des cellules tumorales aux dommages de l'ADN. Les retombées de notre travail seraient donc de contribuer à établir les fondements théoriques pour l'amélioration du pronostique et de la prise en charge thérapeutique du cancer.

  • Titre traduit

    Mediator's and Cohesin's role in the repair of oxidative DNA damage


  • Résumé

    Our laboratory focuses on the base excision repair (BER) mechanism that is responsible for the removal of damaged bases in DNA. Oxidative DNA damage is generated spontaneously by the endogenous metabolism of the cells or induced exogenously by chemical agents or ionizing radiation. The BER pathway has been characterized by biochemical and genetic approaches. More recently we tried to understand how BER complexes are assembled in the context of the cell nucleus in response to genotoxic stress using cell biology approaches. Thus we found that BER proteins are assembled after treatments generating oxidized bases into cellular DNA. These complexes include BER enzymes (DNA glycosylase, AP endonuclease, Polβ and ligase 3) and the scaffold protein that coordinates the process, XRCC1. Very recently, we confirmed the model by a microscopy approach, in which, for the case of the 8-oxoguanine mutagenic lesion, assembly of the BER complex depends on the recruitment of OGG1 on chromatin, OGG1 being the DNA glycosylase that recognizes and excise the lesion. Surprisingly, the recruitment of this initiator protein does not require the recognition of the damage by the protein. This implies that there are signals other than the recognition of the modified base by OGG1 that allow recruitment of the enzyme to the chromatin and thus initiation of the repair of the 8-oxoG by the BER. Preliminary results suggest that this would be true for the recruitment of glycosylases responsible of the excision of other oxidized bases. The project consists to identify new proteins required for recruitment of OGG1 to the chromatin after induction of 8-oxoG into cellular DNA. We have implemented a genome-wide screen to identify genes involved in the recruitment of OGG1. Initial trials have shown the feasibility of the strategy of screening a library of siRNAs. The "read-out" of the screen is a detection of siRNA affecting the recruitment of a functional fluorescent form of DNA glycosylase to the chromatin fraction. Cellular imaging and biochemistry helped to highlight the essential role of certain subunits of the Mediator of transcription in the recruitment of OGG1. A first objective of the thesis will be to further analyze the mediator's role in the recruitment of this DNA glycosylase following oxidative stress. In addition, our own results and data from the literature suggest a close relationship between transcription and repair of different types of DNA damage such as damage induced by UV and double-strand breaks. A second objective will be to compare the results we had with a carcinogen (potassium bromate), with the effects induced by ionizing radiation such as X-rays or gamma rays. Finally, a long-term perspective would be to study the effects of oxidative stress on the repair of 8-oxoguanine in animal models. We currently have knock-out OGG1 - / - and wild-type mice that will be used in this project. The impact of a defect of the identified genes on the recruitment of OGG1, as well as other BER proteins, on the damage sites will be evaluated by confocal microscopy on fixed and living cells. Then, we will characterize the role of the gene in the cascade of events that leads to the initiation of the repair process. The effects of inhibiting the function of the candidate proteins will be assessed by determining parameters such as cell survival under genotoxic stress and the ability of cells to repair 8-oxoG in vivo. A possible protein interaction between the candidate proteins and known elements of the BER will be analyzed and we will evaluate the impact of mutants or polymorphisms on these interactions. The identification of molecular mechanisms and new factors involved in the repair of oxidized bases could be used in the design of new therapies. For example it could provide elements for the selection of chemotherapeutic agents or radiotherapy agents that would optimize the response of tumor cells to DNA damage. The impact of our work would therefore help to establish the theoretical basis for improving prognostic and therapeutic management of cancer.