Régulation de la réponse à divers stress et réparation des cassures double brin de l'ADN chez la bactérie Deinococcus radiodurans

par Laura Meyer

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Pascale Servant.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Deinococcus radiodurans, un des organismes les plus radiorésistants connus à ce jour, est capable de reconstituer en quelques heures un génome fonctionnel à partir d'une centaine de fragments après de fortes doses d'irradiations alors que le génome de la plupart des organismes est irrémédiablement détruit dans les mêmes conditions. Notre équipe s'intéresse à la comprendre les mécanismes de réponse cellulaire mis en jeu par D.radiodurans pour survivre aux effets léthaux des agents génotoxiques. A l'heure actuelle, notre laboratoire cherche à décrypter les réseaux de régulations impliqués dans les réponses cellulaires mises en place chez D. radiodurans pour faire face à un stress génotoxique. Le gène ddrI (DNA damage response gene I) est fortement induit après exposition des cellules aux rayonnements γ (3 kGy) et code pour un régulateur transcriptionnel appartenant à la famille CRP (cAMP receptor protein). Afin de déterminer le rôle biologique de DdrI chez D. radiodurans, nous avons entrepris de caractériser le mutant ΔddrI et d'identifier ces gènes cibles. En comparaison avec la souche sauvage, la délétion de ddrI entraîne de sévères défauts de croissance et sensibilise D. radiodurans aux agents génotoxiques, au stress oxydant et au choc thermique. L'expression de la CRPEC de E. coli dans le mutant ∆ddrI restaure partiellement le phénotype sauvage, ce qui suggère que la CRPEC et DdrI se fixent à des séquences d'ADN proches et nous a permis de réaliser des prédictions in silico des cibles potentielles de DdrI, en utilisant les séquences d'ADN reconnues par la CRPEC. Ces prédictions suggèrent que DdrI régule l'expression de centaines de gènes impliqués dans divers processus cellulaires tels que la réplication et la réparation de l'ADN, la réponse aux stress oxydant et au choc thermique et la transduction de signal etc). Des expériences de retard sur gel ont montré que la séquence consensus pseudopalindromique 5'TGTGA(N6)TCACA3', déterminée à partir des 115 sites de fixation potentiels de DdrI, est spécifiquement fixée par DdrI uniquement en présence d'AMPc. Après un choc thermique, l'implication de DdrI dans l'induction de gènes de réponse au choc thermique (protéases dépendantes de l'ATP (lon1, lon2 and clpB), la sous-unité A de l'ADN gyrase (gyrA), un gène codant une protéine de réponse aux dommages de l'ADN (ddrF), un inhibiteur de la traduction associé au ribosome (raiA) etc) a été confirmée par des expériences de RT-qPCR et un contrôle direct est supposé lorsque les gènes possèdent un site de fixation potentiel de DdrI en amont de leur séquence codante. Par ailleurs, la protéine DdrI est fortement induite lorsque que les cellules sont en phase stationnaire de croissance et des analyses de microscopies par épifluorescence des cellules du mutant ΔddrI, montrent que DdrI est impliquée dans la régulation de la division cellulaire et/ou la ségrégation de l'ADN. Nous avons également démontré que DdrI est impliquée dans la maintenance du mégaplasmide MP1 et dans la transformation efficace des cellules avec de l'ADN plasmidique, en permettant la maintenance du plasmide entrant dans la cellule. L'ensemble de ces données souligne le rôle crucial de DdrI chez D. radiodurans dans la régulation, de manière directe ou indirecte, de processus variés à la fois en condition standard et après un stress cellulaire.

  • Titre traduit

    Response regulation to various stresses and DNA double strand break repair in Deinococcus radiodurans


  • Résumé

    The DNA damage response ddrI gene encodes a transcription regulator belonging to the cAMP receptor protein (CRP) family. Cells devoid of the DdrI protein exhibit a pleiotropic phenotype, including growth defects and sensitivity to DNA-damaging agents and to oxidative stress. Here, we show that the absence of the DdrI protein also confers sensitivity to heat shock treatment, and several genes involved in heat shock response were shown to be upregulated in a DdrI-dependent manner. Interestingly, expression of the Escherichia coli CRP partially compensates for the absence of the DdrI protein. Microscopic observations of ΔddrI mutant cells revealed an increased proportion of two-tetrad and anucleated cells in the population compared to the wild-type strain, indicating that DdrI is crucial for the completion of cell division and/or chromosome segregation. We show that DdrI is also involved in the megaplasmid MP1 stability and in efficient plasmid transformation by facilitating the maintenance of the incoming plasmid in the cell. The in silico prediction of putative DdrI binding sites in the D. radiodurans genome suggests that hundreds of genes, belonging to several functional groups, may be regulated by DdrI. In addition, the DdrI protein absolutely requires cAMP for in vitro binding to specific target sequences, and it acts as a dimer. All these data underline the major role of DdrI in D. radiodurans physiology under normal and stress conditions by regulating, both directly and indirectly, a cohort of genes involved in various cellular processes, including central metabolism and specific responses to diverse harmful environments