Comprendre comment les métabolites, GTP et (p)ppGpp, contrôlent simultanément l'apparition d'erreurs traductionnelles et l'allocation des ressources chez les bactéries.

par Claire Baudier

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Stéphane Aymerich et de Vincent Fromion.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Structure et Dynamique des Systèmes Vivants , en partenariat avec MICALIS- Microbiologie de l'Alimentation au service de la santé humaine (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2014 .


  • Résumé

    Bien que divers mécanismes coopèrent pour empêcher les erreurs lors de la synthèse des protéines chez les bactéries, des erreurs traductionnelles de type « frameshift » (ETFs) ou « faux-sens » peuvent avoir lieu. En particulier, les ETFs ont été détectées à de faibles niveaux lors de la phase de croissance exponentielle et à des niveaux plus élevés durant la phase de croissance stationnaire chez Escherichia coli et Bacillus subtilis. Cesette observations ont a conduit les chercheurs à revoir le rôle de la "réponse stringente " dans la survenue des ETFs, qui constitue l'un des car c'est le mécanismes clé de l'adaptation bactérienne aux changements nutritionnels. Elle résultedécoule de se base sur l'interaction entre un ribosome en cours de traduction et laes protéines RelA/SpoT ce qui permet de détecter les ARNs de transfert (ARNts) non chargés et les ribosomes en cours de traductionet de larésulte en la production d'une molécule appelée (p)ppGpp par RelA/SpoT lors celles-ci détecte un , ce qui conduit à la détection d'ARNs de transfert (ARNts) non chargés. et à la production d'une molécule appelée (p)ppGpp. Dans une souche mutante relA incapable de synthétiser le (p)ppGpp, les erreurs traductionnellesETFs sont fortement augmentées. Dans ce contexte, notre objectif principal a été est de revisiter le rôle de la réponse stringente dans le contrôle des erreurs traductionnelles et de clarifier le rôle des deux métabolites antagonistes GTP et (p)ppGpp. Par exemple, En effet, le GTP stimule l'initiation de la traduction (en ciblant le facteur d'initiation IF2) , alors que le (p)ppGpp inhibe la biosynthèse du GTP et l'initiation de la traduction (en rentrant en concurrence avec le GTP pour se fixer sur IF2). A cette fin, nous avons utilisé le modèle bactérien des bactéries à Gram positif B. subtilis, conçu trois systèmes rapporteurs distincts pour détecter les ETFs et construit une souche incapable de synthétiser du (p)ppGpp (appelée "(p)ppGpp0""). Nous avons observé qu'au cours de la croissance dans les des milieux pauvres, les ETFs augmentent en l'absence de (p)ppGpp durant la phase exponentielle (c'est-à-dire la croissance en régime permanent) et que, contrairement au typeà la souche sauvage, la souche (p)ppGpp0 présente un pic d'ETFs en milieu riche pendant la transition d'un milieu riche à la phase stationnaire. En contrôlant les niveaux intracellulaires de GTP dans la souche (p)ppGpp0, nous avons montré que l'abondance de GTP est le facteur qui déclenche l'apparition des ETFs. Néanmoins, après une "faible" induction de la biosynthèse du GTP conduisant à des taux de croissance sous-optimaux, le niveau d'ETFs forme toujours un pic lors de la transition vers la phase stationnaire, ce qui montre que le mode d'action du (p)ppGpp pour prévenir l'apparition des ETFs ne repose pas uniquement sur son action inhibitrice de la biosynthèse du GTP. Nous nous sommes ensuite alors concentrés sur l'effet inhibiteur du (p)ppGpp sur IF2 et avons mimé imité son action en injectant des drogues connues pour inhiber l'initiation de la traduction. NPar conséquent, nous avons alorsainsi démontré qu'en réduisant l'initiation de la traduction à l'aide de drogues lors de l'épuisement des aminoacyl-ARNts, la souche "(p)ppGpp0" es bactéries de type sauvage est sont capables de contrôler de façon optimale optimale sonle le taux d'ETFs lors dedans la transition vers la phase stationnaire. La même conclusion est obtenue dans le cas d'un niveau élevé de GTP. Dans une deuxième étudepartietemps, nous avons étudié comment la transcription et la traduction sont affectées par les variations du niveau de GTP et de (p)ppGpp. Nous avons observé que les gènes possédant un site de début de"+1" de transcription (SDTTSS, "« transcription start site ») composé de deux guanines (gènes artificiels et ARNs ribosomaux) ont vu leur taux de transcription positivement corrélés été transcrits à desau taux de croissance plus élevés queà l'inverse des les gènes possédant un SDT TSS composé de deux adénines. Cette différence est encore plus prononcée pour llaes souches (p)ppGpp0 cultivées en milieu riche lors de l'ajout de guanosine (ce qui conduit à un niveau élevé de GTP). En conclusion, nous avons démontré que le (p)ppGpp contrôle le niveau 'apparition d'erreurs traductionnelles lors de la croissance en régime permanent en abaissant les niveaux de GTP et lors d'un changement nutritionnel en inhibant spécifiquement l'initiation de la traduction, assurant ce quune i affecte également l'allocation parcimonieuse des ressources au sein de la bactérie de manière globale.

  • Titre traduit

    How do the metabolites, GTP and (p)ppGpp, simultaneously control the occurrence of translational errors and resource allocation in bacteria?


  • Résumé

    Even though diverse mechanisms cooperate to prevent protein synthesis errors in bacteria, missense and translational frameshift errors (TFEs) can occur . In particular, TFEs were detected at low levels in the exponential growth phase and at higher levels in the stationary phase in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. This observation led researchers to revisit the role of the “stringent response” in the occurrence of TFEs since it is the key mechanism involved in the bacterial adaptation to nutritional downshifts. It relies on the interaction between the RelA/SpoT proteins and the translating ribosomes, which leads to the detection of uncharged tRNAs and to the production of an alarmone called (p)ppGpp. In a relA mutant strains unable to synthesize (p)ppGpp, translational errors are highly increased. In this context, the main goal of our work was to revisit the role of the stringent response in the translational error control and to clarify the role of the two key, antagonistic metabolites GTP and (p)ppGpp. Indeed, while GTP enhances translation initiation (targeting the initiation factor IF2) and elongation (targeting the elongation factor EF-Tu) , (p)ppGpp inhibits GTP biosynthesis (reducing the enzyme activity of Gmk, HprT and GuaB) and translation initiation (competing with GTP on IF2). For this purpose, we used the Gram positive model bacterium B. subtilis, designed three distinct reporter systems to detect TFEs and built a strain unable to synthesize (p)ppGpp (called “(p)ppGpp0”). We observed that during growth in poor media TFEs were increased in the absence of (p)ppGpp in the exponential phase (i.e. steady-state growth) and that by contrast to the wild type, the (p)ppGpp0 strain exhibited a TFE burst during the transition in rich medium to the stationary phase. By controlling intracellular levels of GTP in the (p)ppGpp0 strain, we showed that GTP abundance is the trigger factor of TFEs occurrence. Nevertheless, upon a "weak" induction of GTP biosynthesis leading to sub-optimal growth rates, the TFEs rate still peaked during the transition to the stationary phase, which demonstrated that the mode of action of (p)ppGpp to prevent TFEs occurrence did not only rely on its inhibition of GTP biosynthesis. We then focused on the (p)ppGpp inhibitory effect on IF2 and mimicked its action by injecting drugs known to inhibit translation initiation. Hence, we demonstrated that by reducing translation initiation (injecting drugs) upon aminoacyl-tRNAs depletion (p)ppgGp0 wild-strain type cells is are able to optimally control the rate of TFEs in the transition to the stationary phase. The same conclusion is obtained even in presence of a high GTP level. In a second part, we studied how transcription and translation are affected by variations in GTP and (p)ppGpp abundances. We observed that genes possessing a transcription start site (TSS) made of two guanines were more importantly transcribed at higher growth rates than genes possessing a TSS made of two adenines. This difference was even more pronounced for (p)ppGpp0 strains grown in rich medium upon guanosine addition (leading to a high level of GTP). Moreover, the ribosomal RNAs (rrns; for which the TSS is a guanine) synthesis level seemed to be positively correlated to GTP levels during exponential growth in poor and rich media as observed by the modulation of GTP biosynthesis. In conclusion, we demonstrated that (p)ppGpp controls the occurrence of translational errors during steady-state growth by decreasing GTP levels and during a nutritional downshift by specifically inhibiting translation initiation ensuring a parsimonious , which also globally affects resource allocation.