Régulation génetique et épigenetique de la télomérase

par Joelle El Hajj

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Evelyne Segal-bendirdjian.

Thèses en préparation à Paris Saclay en cotutelle avec l'Université Saint Joseph, Faculté de medecine , dans le cadre de Cancérologie : biologie - médecine - santé , en partenariat avec Homéostasie Cellulaire et Cancer (laboratoire) , Homeostasie Cellulaire et Cancer (equipe de recherche) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2014 .


  • Résumé

    Le couple télomère/télomérase apparaît comme une cible prometteuse pour de potentiels agents anticancéreux qui seraient actifs sur un large éventail de tumeurs. Le laboratoire d'accueil a montré dans un modèle de leucémie aiguë promyélocytaire (LAP), qu'un agent utilisé en clinique, l'acide rétinoïque (ATRA), exerce une activité anti-tumorale en réprimant la transcription de la sous-unité télomérasique hTERT indépendamment de la différenciation. Le modèle comporte deux lignées cellulaires de LAP, résistantes à la maturation induite par l'ATRA mais qui diffèrent en termes de régulation de hTERT : dans la lignée NB4-LR1, le traitement prolongé par l'ATRA induit une répression de hTERT et la mort des cellules consécutive au raccourcissement des télomères ; la lignée NB4-LR1SFD résiste à la répression de hTERT même en présence continue d'ATRA. Pour élucider les mécanismes qui ont mené à cette résistance, le laboratoire a abordé deux aspects : 1- Epigénétique, en étudiant les profils de méthylation du promoteur de hTERT riche en CpG, dans les NB4-LR1 et NB4-LR1SFD avant et après traitement ATRA. 2- La technologie « puces à ADN » a été utilisée afin d'identifier de nouveaux gènes et/ou réseaux de signalisation induits par l'ATRA régulateurs de hTERT. Cette approche a été effectuée sur ces variants cellulaires qui constituent des outils de choix pour l'identification de facteurs régulateurs de hTERT et pour la recherche des bases moléculaires de sa réactivation jouant un rôle clé dans la tumorigenèse et à la résistance à la chimiothérapie. L'analyse bioinformatique nous a permis de construire des profils d'expression différentielle entre les 2 lignées et des réseaux d'interaction. Les travaux préliminaires ont été consacrés à valider les gènes candidats identifiés dont celui codant l'ARN long non codant H19. H19 est un ARN long de 2.5kb, polyadénylé et non codant. Il est classé parmi les gènes suppresseurs de tumeur : en son absence il y a développement de cancer (tumeur de Wilms, rhabdomyosarcoma, syndrome de Beekwith-Wiedeman). Cependant, H19 est de plus en plus reconnu comme un oncogène. Nous avons mis au point la mesure d'expression de H19 par RT-PCR quantitative, validé les données obtenues dans l'analyse « puce à ADN » et montré que le traitement ATRA induit l'expression de H19 dans les cellules NB4-LR1 alors que cette expression est plutôt diminuée dans les cellules NB4-LR1SFD. L'induction observée dans les cellules NB4-LR1 existe indépendamment de la différenciation. Par contre, cette induction peut être observée associée à la différenciation dans les 3 lignées cellulaires. Ainsi nous montrons, comme pour hTERT, deux niveaux de régulation de H19 par l'ATRA, un associé à la différenciation et un indépendant. Les travaux futurs étudieront l'hypothèse d'un lien mécanistique (directe ou indirecte) entre l'expression de H19 et celui de hTERT et l'activité télomérasique. Pour cela nous utiliserons des outils cellulaires déjà élaborés au laboratoire : lignées de cellules NB4 et NB4-LR1 surexprimant de façon ectopique hTERT ou invalidées pour H19. Sachant que H19 est le précurseur d'un microARN, le mir-675, impliqué dans la régulation de plusieurs gènes cibles, nous analyserons l'expression du mir-675 dans les cellules NB4, NB4-LR1 et NB4-LR1SFD soumises aux traitements décrits précédemment. Si l'expression du mir-675 suit les variations précédemment démontrées pour l'expression H19, nous étudierons les conséquences de l'invalidation du mir-675 sur la réponse biologiques des cellules et l'expression des cibles connues de ce miRNA.

  • Titre traduit

    Genetic and epigenetic regulation of telomerase


  • Résumé

    The couple telomere / telomerase appears to be a promising target for potential anticancer agents that are active on a broad range of tumors. The host laboratory showed in a model of acute promyelocytic leukemia (APL), that a clinically used agent, the retinoic acid (ATRA), has anti-tumor activity by repressing transcription of the telomerase subunit hTERT independently of differentiation. The model is composed of two LAP cell lines, resistant to ATRA induced maturation but that differ in terms of regulation of hTERT: in NB4-LR1 cell line, the extended ATRA treatment induces repression of hTERT and death of cells consecutive to telomere shortening; the NB4-LR1SFD cell line resists to the repression of hTERT even in the continued presence of ATRA. To elucidate the mechanisms that led to this resistance, the laboratory has addressed two aspects: 1 Epigenetics, studying the methylation patterns of the hTERT promoter, rich in CpG, in the NB4-LR1 and NB4-LR1SFD before and after ATRA treatment. 2- "micro-array" technology is been used to identify new genes and / or signaling networks induced by ATRA and that might be regulators of hTERT. This approach has been performed on these cell variants which are instruments of choice for identification of hTERT regulatory factors and to search the molecular basis of its reactivation, playing a key role in tumorigenesis and resistance to chemotherapy. Bioinformatic analysis enabled us to build differential expression profiles between the 2 cell lines. Preliminary work is been done to validate the identified candidate gene that encodes the long noncoding RNA H19. H19 is a 2.5kb long RNA, polyadenylated and non-coding. It is classified as a tumor suppressor gene: in its absence there is development of cancer (Wilms tumor, rhabdomyosarcoma, Beekwith-Wiedeman syndrome). However, H19 is recognized nowadays as an oncogene. We developed the measurement of H19 expression by quantitative RT-PCR, validated the data obtained in "microarray", and showed that ATRA treatment induced the expression of H19 in NB4-LR1 cells and not in NB4-LR1SFD cells. The induction observed in NB4-LR1 cells exists independently of differentiation. However, this induction can be observed associated with differentiation in the 3 cell lines. Thus we show, as hTERT, two H19 regulatory levels by ATRA, one associated with differentiation and one independent. Future work will examine the hypothesis of a mechanistic link (direct or indirect) between the expression of hTERT, H19 and the telomerase activity. For this, we will use cellular tools already developed in the laboratory: NB4 and NB4-LR1 cells overexpressing hTERT ectopically or H19 - invalidated. Knowing that H19 is the precursor of a microRNA, mir-675, involved in the regulation of several target genes, we will analyze the expression of mir-675 in NB4 cells, NB4-LR1 and NB4-LR1SFD subject to the treatments described previously. If the expression of mir-675 follows the variations previously demonstrated for H19 expression, we will study the consequences of the invalidation of the mir-675 on the biological response of cells and the expression of known targets of this miRNA.