Identification et caractérisation de nouvelles cibles thérapeutiques dans la Leucémie Aiguë Myéloïde

par Lina Benajiba

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Olivier Hermine.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Cancérologie : biologie - médecine - santé , en partenariat avec Institut IMAGINE (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement opérateur d'inscription) .


  • Résumé

    La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une pathologie hématologique dont le pronostic reste très défavorable, malgré les progrès réalisés dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-tendant son développement. Identifier de nouvelles stratégies anti-leucémiques représente donc une étape clé dans la concrétisation des avancées thérapeutiques. Grâce à la combinaison de plusieurs approches de criblage génétiques et pharmacologiques, l'objectif de ma thèse a été de définir et valider de nouvelles cibles thérapeutiques dans les LAM. La première partie de ma thèse a eu pour but de transposer en clinique l'inhibition de la Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3). GSK3, une kinase clé dans la régulation de la voie de signalisation WNT, a été précédemment identifiée comme cible thérapeutique dans les LAM. Bien que de multiples inhibiteurs de GSK3 aient fait l'objet d'essais cliniques, aucun n'a représenté un succès thérapeutique. La stabilisation de la b-caténine secondaire à l'inhibition concomitante des deux paralogues de GSK3, représente un obstacle à l'utilisation clinique de cette classe thérapeutique. L'inhibition individuelle de GSK3α ou de GSK3β ne stabilise pas la b-caténine et offre ainsi une solution conceptuelle au ciblage de GSK3. La synthèse d'inhibiteurs sélectifs a posé un défi de chimie médicinale en raison de la forte homologie dans le domaine de liaison ATP. Mettant à profit la présence d'un «switch» Asp133 à Glu196 dans les domaines de liaison ATP de GSK3, nous avons identifié un inhibiteur sélectif du paralogue GSK3α et mené des études précliniques validant le BRD0705 comme nouveau traitement pro-différenciant dans les LAM. Nous avons montré que le BRD0705 inhibe la fonction kinase de GSK3a; et ne stabilise pas la β-caténine, atténuant ainsi les problèmes néoplasiques potentiels. Nous avons démontré que le BRD0705 induit la différenciation myéloïde et altère la formation de colonies de cellules leucémique, sans effet apparent sur les cellules hématopoïétiques normales. De plus, le BRD0705 inhibe l'initiation de la leucémie et prolonge la survie de modèles murins de LAM. Cette collaboration entre biologie et chimie a donc mené à l'identification BRD0705 en tant que thérapie potentielle de la LAM. De plus, une combinaison de profilage métabolomique et d'approches de criblage haut débit à l'aide d'une banque de shRNAs a permis d'identifier un nouveau lien entre EVI-1, la voie de la créatine kinase (CK) et la voie de signalisation GSK3. La CK mitochondriale (CKMT1), a été identifiée comme nouvelle cible dans la LAM EVI-1-positive, un sous-type de LAM à haut risque. La deuxième partie de ma thèse a porté sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques en utilisant une approche de criblage par banque de shRNAs dans le modèle murin de LAM porteur de la translocation MLL-AF9. VCP, une AAA-ATPase, a ainsi été identifiée comme cible thérapeutique. La sensibilité d'un panel de cellules leucémiques (lignées et cellules primaires) à l'inhibition de VCP a été validée en utilisant des shRNA, la surexpression d'un mutant dominant négatif, et l'inhibition pharmacologique de VCP. Nous avons identifié que l'inhibition de la fraction nucléaire, mais pas de la fraction cytoplasmique de VCP, est suffisante pour diminuer la viabilité des cellules leucémiques. En outre, en analysant par spectrométrie de masse l'interactome de VCP, nous avons déterminé que VCP interagit avec le complexe Replication Protein A (RPA), contribuant à la phase initiale de la recombinaison homologue (HR). VCP orchestre la génération d'une plateforme à ADN simple brin recouverte de RPA, ce qui entraîne l'activation de la kinase ATM et la HR. Nous avons ainsi mis à jour le rôle central de VCP dans la réparation de l'ADN. Dans leur ensemble, nos découvertes permettent une meilleure compréhension de la biologie des LAM et participeront ainsi à l'amélioration des traitements futurs de cette pathologie.

  • Titre traduit

    Identification and characterization of new therapeutic targets in Acute Myeloid Leukemia


  • Résumé

    Despite the significant progress made in understanding Acute Myeloid Leukemia oncogenesis over the last decades, this disease remains devastating and the overall five-year survival does not exceed 17%. Developing new translational research strategies focused on the identification of druggable oncogenic targets is critical to continued progress in AML treatment. The goal of this work was to define and validate novel leukemia-specific dependencies using small-molecule inhibitors and RNA-interference-based high-throughput screening methods. The first part of my thesis work aimed at translating Glycogen synthase kinase 3 (GSK3) inhibition into the clinic. GSK3, a key regulatory kinase in the WNT pathway, was previously identified as a promising therapeutic candidate in AML. Although dual GSK3a/b; inhibitors have entered clinical trials, none was successfully translated to clinical application. Mechanism-based toxicities, driven in part by the inhibition of both GSK3 paralogs and subsequent b-catenin stabilization, were a concern in the clinical translation of this target candidate. Specific knock-down of GSK3a or GSK3b alone does not increase β-catenin, thereby offering a conceptual resolution to GSK3 targeting. The design of selective ATP–competitive inhibitors posed a drug discovery challenge due to the high homology in the GSK3a and GSK3b; ATP binding domains. Taking advantage of an Asp133 Glu196 “switch” in the GSK3 paralog hinge binding domains, we identified a first-in-class GSK3a; selective inhibitor and conducted preclinical studies validating BRD0705 as a promising new differentiation therapy in AML. BRD0705 inhibited GSK3α kinase function and did not stabilize b-catenin, thereby mitigating potential neoplastic concerns. BRD0705 induced myeloid differentiation and impaired colony formation in AML cells, with no apparent effect on normal hematopoietic cells. Moreover, BRD0705 impaired leukemia initiation and prolonged survival of various AML mouse models. This fruitful collaboration between biological and chemical laboratories led to the identification and validation of BRD0705 as a new potential therapy in AML. In addition, a combination of a metabolomic profiling and a pooled shRNA screening method identified a new interplay between the oncogene EVI-1, the creatine kinase (CK) pathway and GSK3 signaling. The mitochondrial CK (CKMT1), was thus uncovered as a new target in EVI-1-positive AML, a high-risk AML subtype. We established that the use of the CK pathway inhibitor, cyclocreatine, inhibited GSK3 signaling in EVI1-positive AML cells, thereby decreasing their viability. According to these data, overexpression of a constitutive active form of GSK3 was sufficient to partially abrogate the deleterious effect of CKMT1 inhibition. The second part of my studies focused on identification of new therapeutic targets using an in vivo pooled shRNA screening approach in the MLL-AF9-driven AML mouse model. VCP, an AAA-ATPase, was thus identified as a top target. The sensitivity of a panel of human AML cell lines and primary patient samples to VCP inhibition was validated using VCP-directed shRNAs, overexpression of a dominant negative VCP mutant, and chemical inhibition. We identified that inhibition of the nuclear, but not the cytoplasmic fraction of VCP, was sufficient to abrogate leukemic cell viability. In addition, using a mass spectrometry-based analysis of the VCP interactome, we determined that VCP interacts with the replication protein A (RPA) complex, contributing to the initial phase of homologous recombination (HR). VCP orchestrates RPA-coated-single-stranded-DNA platform generation, resulting in ATM kinase activation and subsequent HR. We thus unraveled a central role of VCP in DNA repair as a druggable target in AML. Taken together, our discoveries increased our understanding of AML biology and may therefore contribute to novel and more efficacious treatments for this highly aggressive and lethal disease.